基于网络药理学和数据分析方法研究中药调控冠心病发展的铁死亡关键基因※

胡泰然 李雪苓

(1.安徽中医药大学2019级硕士研究生，安徽 合肥 230000；2.安徽中医药大学第一附属医院心血管内科，安徽 合肥 230000)

冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型，是全球人类死亡的首要原因[1]。在我国，2018年以来，冠心病的死亡率更是超过了肿瘤等其他疾病而位居首位，且呈逐年升高趋势[2-3]。冠心病主要的病理变化是动脉粥样斑块的形成及发展。研究表明，铁死亡的机制与心血管疾病的发生发展密切相关。细胞铁死亡是铁依赖途径的脂质过氧化[4]，是区别于细胞凋亡、坏死和自噬的新型细胞程序性死亡方式。2003年最早由美国Stockwell B团队在研究抗癌药物时发现，并在随后的研究中命名为“ferroptosis(铁死亡)”。其产生的作用机制主要有2种[5]，一种是细胞内的游离铁离子通过芬顿反应(fenton reaction)与过氧化氢相互作用，发生脂质过氧化从而产生过多的不饱和脂肪酸，造成细胞的程序性死亡，可能与谷胱甘肽(GSH)合成减少有关；另一种是铁蛋白的转换异常，使细胞外的铁离子数量异常升高，也称“铁过载”。近年来，随着铁死亡研究的进展，其与冠心病的关系也有了更加合理的解释[6]。在冠心病发展的早期，氧化应激是其主要的病理因素之一，过氧化酶(POD)会导致细胞器脂质过氧化，同时介导炎性反应而导致炎症介质沉积，加速冠状动脉粥样硬化的发展。随着病情的进展，铁死亡等其他细胞程序性死亡广泛发生，并诱导斑块的不稳定、破裂，是影响冠心病中晚期发展的关键因素[7]。

中药治疗冠心病疗效确切，具有多靶点、多途径、经济成本低等优势，中药中的多种成分也已经被证明具有抑制脂质过氧化的作用[8]。本研究结合网络药理学技术[9]和数据分析方法，以铁死亡为分析方向，筛选中药调控冠心病的关键靶点，为中药治疗冠心病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 铁死亡相关基因和冠心病相关基因的获取 铁死亡相关基因通过搜索检索词“ferroptosis”从FerrDb数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb)获取，并选择“Driver”“Suppressor”“Marker”模块，下载铁死亡相关基因文件，再通过检索文献，补充未收录的铁死亡相关基因，去除重复值后获得铁死亡相关基因。登录OMIM(https://omim.org)、GeneCards(https://www.genecards.org)、DurgBank(https://www.drugbank.com)、Disgenet(https://www.disgenet.org)数据库，搜索指令设置为“Coronary Heart Disease”，物种设置为“human”，检索冠心病相关基因，去除重复值及转换、规范基因名后获得冠心病相关基因。

1.2 “铁死亡-冠心病”交集基因获取及蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建 将筛选得到的铁死亡相关基因和冠心病相关基因数据导入Excel表格中，合并成一列后选择“条件格式—突出显示单元格—重复值”，得到的重复值即为“铁死亡-冠心病”交集基因，并通过微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)平台制作韦恩图展示。将交集基因导入STRING(https://string-db.org)数据库，最高置信度设置为0.7，去除游离没有关联的蛋白，下载得到PPI文件。文件导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化处理，构建“铁死亡-冠心病”PPI网络，选择“Cytohub”插件分析节点连接度值(Degree值)、节点介度和节点紧密度，并根据Degree值的大小设置网络图的节点(node)、边(edge)、颜色(colour)，最终分析得到Degree值排名前20的基因为“铁死亡-冠心病” 关键基因靶点。

1.3 基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 为分析铁死亡蛋白的生物功能、细胞组成和化学成分，以及其所涉及的信号通路，将“铁死亡-冠心病”交集基因导入Metascape平台(https://metascape.org)，得到GO功能和KEGG通路富集分析文件，将文件转换后导入R软件，利用“ggplot”包构建富集分析图，并分别制作GO气泡图和KEGG柱状图。

1.4 含有“铁死亡-冠心病”关键基因的关键中药获取 将Degree值排名前20的“铁死亡-冠心病” 关键基因分别导入UniProt(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)数据库，物种设置为“human”，相关研究设置为“已验证”，获取蛋白名全称。将蛋白全称输入中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com)，得到含有“铁死亡-冠心病”关键基因的相关中药。为明确每个中药中所包含的“铁死亡-冠心病”关键基因的多少，将相关中药按照关键基因名分组，此处假设得到了X个关键基因，即分为X组，并全部导入Excel表格中，合并为一列,先将所有组合并为一列,通过选择“条件格式—突出显示单元格—重复值” 筛选出的重复值即为包含所有关键基因(X个)的中药。按照此法，依次递减(每次递减一组)需要合并为一列并筛选重复值的组数，得到包含X-1、X-2、X-3、X-4……个关键基因的中药，最终将包含10个及以上关键基因的中药为关键中药，并作为本研究的对象。它们即包含了多种铁死亡基因，又有作用于冠心病的靶点。

1.5 “中药-成分-靶点”网络构建及“中药-冠心病”PPI网络构建 将筛选得到的关键中药导入TCMSP，设置筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18，得到中药活性成分及其作用的靶点，靶点转换、规范基因名，并运用Cytoscape 3.8.2软件制作“中药-成分-靶点”网络图。然后将所得的中药靶点基因和冠心病疾病基因导入Excel中，通过选择“条件格式—突出显示单元格—重复值”筛选交集基因，并将交集基因导入STRING数据库进行分析，结果再次导入Cytoscape 3.8.2软件，构建“中药-冠心病”PPI网络，并通过“Cytohub”插件分析拓扑学参数，筛选得到Degree值排名前10的基因为“中药-冠心病”核心基因靶点。

1.6 中药调控冠心病相关铁死亡关键基因的获取 将“铁死亡-冠心病”核心基因与“中药-冠心病”关键基因取交集，得到中药调控冠心病相关铁死亡的关键基因，并通过微生信平台制作韦恩图展示。

2 结果

2.1 铁死亡相关基因和冠心病相关基因的获取 从FerrDb数据库不同模块中和文献检索共得到383个铁死亡相关基因靶点，除去重复值后得到259个铁死亡相关基因。从OMIM、GeneCards、DurgBank、Disgenet数据库中共得到7717个冠心病疾病相关基因，去除重复值后得到955个疾病相关基因。

2.2 “铁死亡-冠心病”交集基因获取及PPI网络构建 将筛选得到的259个铁死亡基因和955个冠心病基因取交集,最终得到161个“铁死亡-冠心病”交集基因(见图1)。利用Cytoscape 3.8.2软件制作“铁死亡-冠心病”PPI网络图(见图2)，结果显示共有153个节点，1587条边，颜色越深的节点代表Degree值越高，互作关系越强。通过“Cytohub”插件筛选得到Degree值排名前20的基因为“铁死亡-冠心病”关键基因靶点(见表1)。

图1 “铁死亡-冠心病”交集基因韦恩图

图2 “铁死亡-冠心病”PPI网络图

表1 “铁死亡-冠心病”关键基因

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析共获得201个搜索结果，其中生物过程(BP)有68个结果，主要涉及化学应激、活性氧化物的代谢过程、细胞死亡的调节、氧化水平的反映、多细胞有机体的形成、超氧化物的代谢、炎症反应；细胞组分(CC)有53个结果，主要涉及氧化酶复合物、次生溶酶体、转移酶复合物、内分泌囊泡、细胞膜筏；分子功能(MF)有80个结果，主要涉及氧化酶活性、蛋白质韧带结合、转录因子绑定、铁离子结合、p53绑定、线粒体蛋白激酶结合。按照P值由大到小排序，对排名前20的结果制作气泡图进行展示(见图3)。KEGG通路富集分析共得到40条通路，主要涉及流体剪应力和动脉粥样硬化通路、自噬相关通路、铁死亡通路、叉头转录因子O亚族(FoxO)信号通路、自噬-动物信号通路、晚期糖基化终末产物(AGE) -晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路，提示铁死亡可能通过这些通路影响冠心病的发展。按基因富集的数量由大到小排序，对排名前13的通路制作柱状图进行展示(见图4)。

图3 GO功能富集分析气泡图

续图3 GO功能富集分析气泡图

图4 KEGG通络富集分析柱状图

2.4 含有“铁死亡-冠心病”关键基因的关键中药获取 将2.2项获得的20个“铁死亡-冠心病”关键基因靶点分别导入UniProt数据库，转换成基因全称后结果导入TCMSP平台，发现有5个基因未筛选到相关中药，最终有15个“铁死亡-冠心病”关键基因共得到498种中药。通过分析发现，不同基因所相关的中药数量是不同的(见图5)。同时根据Excel数据分析结果显示，包含10种及以上关键基因的中药共有7味，分别为麻黄、芫荽、余甘子、黄芩、丹参、青蒿、葛根，其中青蒿、葛根所包含的基因数最少，为13种，麻黄、芫荽、余甘子、黄芩、丹参均为14种(见图6)，没有得到包含所有关键基因的中药。其余的中药因包含的关键基因数量过少，故排除。

图5 15个“铁死亡-冠心病”关键基因所含中药数

图6 含“铁死亡-冠心病”关键基因最多的前7味中药

2.5 “中药-成分-靶点”网络构建及“中药-冠心病”PPI网络构建 选取中药麻黄、芫荽、余甘子、黄芩、丹参、青蒿、葛根通过TCMSP数据库，筛选得到62种活性成分和356个靶点。将结果导入Cytoscape 3.8.2软件构建“中药-成分-靶点”网络(见图7)，共有361个节点，1731条边，颜色越深、节点越大、透明度越高的节点Degree值越高。将356个中药靶点基因与955个冠心病疾病基因取交集，得到129个交集基因。将129个交集基因导入STRING平台，并利用Cytoscape 3.8.2软件构建“中药-冠心病”PPI网络(见图8)。通过“Cytohub”插件分析Degree值排名前10的基因为“中药-冠心病”核心基因靶点(见表2)。

图7 “中药-成分-靶点”网络图

图8 “中药-冠心病”PPI网络图

表2 “中药-冠心病”核心基因靶点

2.6 中药调控冠心病相关铁死亡关键基因的获取 将2.2项筛选得到的20个“铁死亡-冠心病”关键基因与2.5项筛选得到的10个“中药-冠心病”核心基因取交集，最终获得8个交集基因靶点(见图9)，即TP53、MAPK1、MAPK8、Jun、IL-6、STAT3、VEGFA、MAPK3。其中Jun是转录因子复合物激活蛋白-1(AP-1)的主要成分，主要参与细胞增殖、分化和凋亡，以及人类不同的肿瘤细胞的生长、增殖[10]，由于缺乏实验验证其与冠状动脉粥样硬化的相关，故排除。同时，文献检索发现，PTGS2与铁死亡和冠状动脉粥样硬化的相关性较强[11]，可作为关键基因靶点。这些基因靶点既是铁死亡在冠心病中的关键位点，也是中药调控铁死亡的关键靶点，是本研究分析得到的中药调控冠心病发展的铁死亡关键基因。

图9 “铁死亡-冠心病”关键基因

3 讨论

冠状动脉粥样硬化导致的冠心病，特别是急性冠状动脉综合征，是威胁人类生命，造成全球死亡率升高的主要原因之一[12]。铁死亡是导致多种疾病发生发展的新的病理机制。目前已经有研究发现，铁死亡在抗癌药物的研发、帕金森的治疗、肺部疾病、急性肾损伤中具有重要作用[13-17]，但在冠心病发展中的作用尚缺乏相关研究，特别是在斑块的形成、破裂及管腔狭窄方面。

本研究通过相关数据库和文献搜索、PPI网络构建，筛选出铁死亡在冠心病中的关键基因靶点，通过GO和KEGG分析显示铁死亡基因在冠心病的发展中主要参与氧化反应、炎性反应及细胞的代谢过程，这可能与铁死亡脂质过氧化的发生机制有关。Su L J等[18]研究显示，脂质过氧化介质会促进细胞释放高迁移率族蛋白B1(HMGB1)而诱导炎性反应，在用亚硝酸钠(谷胱甘肽过氧化物酶4激活剂)后，小鼠的炎症因子IL-1、IL-6水平显著降低，说明铁死亡可能是炎症的起始因素，具有促炎作用。KEGG通路富集分析显示，排名前3名的通路为流体剪应力和动脉粥样硬化通路、自噬相关通路及铁死亡通路。流体剪应力是血流在血管内流动时产生的摩擦力，与血流速度有关。有研究发现，正常范围内的血流速度会抑制炎症信号，激活、稳定血管的通路，而高于或低于正常的血流速度则会诱导炎症信号，抑制稳定血管的通路[19]。血流紊乱也会通过增加纤维连接蛋白激活氧化的低密度脂蛋白，抑制一氧化氮合酶(eNOS)的激活和一氧化氮(NO)的产生而影响血流状态，诱导内皮功能障碍，导致动脉粥样硬化[20]。铁死亡在血流动力学改变的情况下或许参与了这一过程。自噬和铁死亡作为不同类型的细胞死亡形式，具有密切联系，许多铁死亡调控因子如肿瘤抑制因子p53、热休克蛋白B1(HSPB1)、重组蛋白因子CDGSH铁硫结构域1(CISD1)、长链酯酰辅酶A合成酶4(ACSL4)已被证实为自噬的潜在调控因子[21]。Kang R等[22]发现，自噬条件下，Fe2+会在溶酶体内降解，随着Fe2+的减少，Fe3+铁增多，进而诱导氧化应激的发生，而氧化应激损伤同样是冠状动脉粥样硬化发展的病理因素。

在获得Degree值排名前20的“铁死亡-冠心病”关键基因后，通过频数分析得到了与“铁死亡-冠心病”关键基因关联最密切的7味中药，分别为麻黄、黄芩、芫荽、余甘子、丹参、青蒿、葛根。其中丹参活血化瘀，祛瘀生新；黄芩清热燥湿，泻火解毒；葛根清热降火，生津止渴；青蒿清湿热，退虚热；麻黄发汗解表，宣肺平喘，利水消肿；芫荽发汗透疹，消食下气，醒脾和中；余甘子清热凉血，消食健脾，生津止渴。现代药理研究显示，丹参的主要成分丹参素具有抗炎、抗血小板聚集、抗冠状动脉粥样硬化、保护心肌能量代谢的作用[23]，已广泛应用于临床，如中成药复方丹参滴丸的主要成分即为丹参素，其联合氯吡格雷片抗血小板聚集的效果明显优于单用复方丹参滴丸或氯吡格雷片[24]。Zhang Y等[25]研究发现，丹参素可以调控谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，通过增强GSH-Px的活性来减轻氧化应激损伤，抑制细胞铁死亡。黄芩的主要成分为黄芩苷，也称黄芩素，能通过抑制活性氧(ROS)发挥抗氧化作用，进而抑制铁死亡[26]。葛根的主要成分为葛根素[27]，具有抗炎、抗氧化、改善心肌能量代谢的作用，还能通过上调热休克蛋白72(HSP72)因子的表达来减缓细胞脂质过氧化和铁过载[28]。青蒿的主要成分青蒿素具有抗炎、抗肿瘤、抗心律失常的作用[29]，目前青蒿素通常用于铁死亡的诱导剂参与肿瘤药物的研发[30]。麻黄、芫荽、余甘子在铁死亡和心血管病领域的研究较少，其中芫荽为伞状科植物芫荽的全草和果实，又名胡荽，有研究显示，其主要成分具有抗氧化的作用[31]，可能通过这一机制抑制细胞铁死亡。

通过多次取交集及文献检索，最终得到了中药调控冠心病相关铁死亡的8个关键基因，分别为TP53、PTGS2、IL-6、STAT3、VEGFA、MAPK1、MAPK3、MAPK8。Tarangelo A等[32]通过细胞实验发现, 肿瘤抑制因子TP53可以增强GSH的活性，减少ROS的产生和能量消耗，抑制细胞铁死亡。Kolovou V等[33]研究显示，TP53基因频率越低，发生冠状动脉疾病和心血管事件的风险性越高。说明TP53不仅在肿瘤疾病中发挥作用，对冠心病的发展同样具有影响。最新研究发现，PTGS2在冠心病的发展过程中表达上调，是铁死亡在冠心病发展中的枢纽基因[33]。IL-6、STAT3作为炎症相关因子，参与炎性反应，而炎性反应产生炎症介质是冠状动脉硬化斑块早期形成的病理因素之一[34]。VEGFA表达降低是导致血管内皮障碍的关键因素，这可能与miR-451的调控有关[35]。MAPK1、MAPK3、MAPK8都属于丝裂原活化蛋白激酶家族分子，可以通过激活ROS参与细胞增殖、分化、死亡等多个细胞过程。Chang W T等[36]发现，细胞铁死亡同样可以通过MAPK激活ROS参与细胞过程。

本研究通过网络药理学和数据分析的方法构建“铁死亡-冠心病”PPI网络及“中药-冠心病”PPI网络，筛选分析出“中药-冠心病-铁死亡”三者共同的相关基因。结果显示，麻黄、芫荽、余甘子、黄芩、丹参、青蒿、葛根可能通过调控细胞铁死亡的途径参与治疗冠心病,具体药理机制需要进一步的实验研究。TP53、PTGS2、IL-6、STAT3、VEGFA、MAPK1、MAPK3、MAPK8是本研究得出的中药从铁死亡途径调控冠心病的关键基因，这些基因可能是中药在治疗冠心病过程中的重要作用靶点，也可能是参与调节、传导等，但其具体的通过何种通路治疗冠心病有待在后续的研究中验证。