黄瓜CsNAC032基因的克隆及盐胁迫响应分析

李宝昌， 陈 岳，2， 张 涵， 张微微

(1.上海农林职业技术学院，上海 201699； 2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240)

转录因子在调节植物生长和逆境响应中发挥着至关重要的功能。其中NAC类家族蛋白是植物特有的转录因子之一，其名字来源于矮牵牛的NAM (no apical meristem)、拟南芥的ATAF1/2 (transcription activation factor)和CUC2 (cup-shaped cotyledon)的首字母缩写而成。NAC转录因子具有独特的结构特征，N端含保守的蛋白结构域，该结构域由A、B、C、D、E等5个亚结构域组成。NAC转录因子在植物生长发育和胁迫响应中均发挥重要作用。例如拟南芥受到HO、NaCl和聚乙二醇的诱导表达，并通过响应这些胁迫促进叶片的衰老。此外，拟南芥的、和均受到盐、干旱、脱落酸和茉莉酸的诱导表达。

黄瓜(L.)是葫芦科一年生草本植物，是我国主要蔬菜作物之一。由于黄瓜根系脆弱、好气、分布浅，因此对盐胁迫十分敏感。发生盐害时，会对黄瓜的产量和品质造成严重影响。因此，黄瓜耐盐是近年研究热点之一。刘东让等对黄瓜耐盐种质资源进行了筛选，同时提出了当前黄瓜耐盐胁迫育种中存在的问题。Zhu等在烟草中过表达黄瓜的基因，发现可以影响烟草中多胺和乙烯的合成，进而提高烟草耐盐性。Liu等利用耐盐亲本CG104和对盐敏感的亲本CG37构建了重组自交系群体，通过图位克隆获得了1个耐盐相关的主效QTL，并提出了2个候选基因。尽管NAC基因在植物中的耐盐研究报道了很多，在黄瓜中却鲜有报道。本研究通过同源克隆获得了黄瓜基因，并对其进行了生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析了该基因在不同器官中的表达，在此基础上进行盐胁迫，分析处理后该基因的表达，为今后深入研究其功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 基因的克隆与鉴定

在TAIR网站下载拟南芥NAC032(AT1G77450)的蛋白序列，将该序列比对到黄瓜9930 V2版基因组(http：//cucurbitgenomics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese_long/v2/)，获得NAC032在黄瓜中的同源基因，将其命名为。在编码区设计特异引物CsNAC032_F(5′-A T G A C C T T A G C T G G G C T C G T G-3′)和CsNAC032_R(5′-T T A A A T C T G C C T C T G T A G A T A A G A A A A C-3′)。以黄瓜叶片的cDNA为模板，CsNAC032_F和CsNAC032_R为引物，选用TaKaRa公司的PrimeSTAR Max Premix进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。将目标片段连接至pClone007 Blunt Vector克隆载体，热激法转化DH5α感受态细胞，用通用引物进行菌落PCR筛选，将阳性克隆送往上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2 CsNAC032的生物信息学分析

利用Expasy网站的“Compute pI/Mw tool”对的等电点与分子量进行预测。利用ProtComp 9.0网站对的亚细胞定位进行预测。利用PlantCARE网站的“Search for CARE”对的转录起始点上游2 000 bp的序列进行启动子元件预测。从NCBI (http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/)网站中下载植物NAC-like序列(表1)。利用DNAMAN软件对10种植物的序列进行多序列比对，并通过MEGA X软件构建Neighbor Joining系统进化树(bootstrap值为1 000)。

表1 不同植物的NAC-like蛋白信息

1.3 黄瓜CsNAC032的表达分析

2021年9月在上海农林职业技术学院五厍实训基地种植黄瓜自交系9930。当黄瓜幼苗生长到5张真叶时，取根、茎、叶、子叶；当黄瓜生长到20节位时，取雄蕊，雌蕊，花瓣，果刺，果皮，卷须。当黄瓜处于5张真叶时，将100 mmol/L的NaCl添加到营养液中，并在处理后的1、3、6、12、24 h分别取叶片，每次取样3个重复。样本采取后立即置于液氮中，放于-80 ℃冰箱中备用。

通过全能型植物RNA提取试剂盒(DNase Ⅰ)分别提取各个器官的总RNA，然后利用反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit将RNA反转录成cDNA。根据基因编码区序列，设计特异性引物RT-CsNAC032F(5′-T T C A G A T T T C A C C C T A C T G A T G A G-3′)和RT-CsNAC032R(5′-G A G A T C A A T C T C C T T G A T G A T G G-3′)，用HiFiScript cDNA Synthesis Kit试剂进行qRT-PCR试验，检测在黄瓜不同器官以及盐处理后的表达情况。黄瓜()基因为对照。定量PCR相关试剂均购买于江苏康为世纪生物科技股份有限公司。使用CFX96 TouchReal-Time PCR System进行反应，采用2-ΔΔ方法进行基因的相对表达量分析。

2 结果与分析

2.1 RNA提取与基因克隆

通过Blast比对，获得拟南芥基因在黄瓜中的同源基因，将其命名为。利用黄瓜叶片cDNA对进行扩增，电泳检测后发现在1 000 bp位置有单一条带(图1)。将该片段回收后连接克隆载体进行转化，测序结果显示基因CDS长900 bp，编码299个氨基酸，其相对分子质量是34 271.63，等电点是5.67。亚细胞定位预测定位于细胞核，符合其转录因子的特性。

2.2 CsNAC032的进化分析

利用DNAMAN软件对黄瓜的CsNAC032和其他植物的9条NAC-like蛋白序列进行相似性比对(图2)。结果表明，黄瓜CsNAC032与甜瓜的CmNAC-like和冬瓜的BhNAC-like同源性最高，分别是97.00%和95.00%，与印度南瓜、中国南瓜、西葫芦、苦瓜、野生灰籽南瓜、拟南芥、水稻的 NAC-like 蛋白同源性依次降低，分别为86.09%、85.76%、85.43%、82.24%、73.79%、56.92%、52.44%。此外，这些序列均拥有NAC家族蛋白典型的保守结构域，在N端约150个氨基酸中共包含A、B、C、D、E等5个保守的亚结构域。

为了分析黄瓜的CsNAC032在进化中的位置，利用多序列比对的10条蛋白序列构建了系统进化树，结果(图3)显示，10条蛋白序列分为2组， 水稻的ONAC048和拟南芥的NAC032聚为一组，葫芦科植物的NAC-like蛋白序列聚为另一组。其中，黄瓜CsNAC032与甜瓜的CmNAC-like和冬瓜的BhNAC-like蛋白又聚为同一亚组，说明它们的亲缘关系较近，与多序列比对的结果一致。

2.3 启动子元件分析

利用Plantcare对起始密码子上游 2 000 bp 的启动子区域进行分析(表2)，结果表明，在转录起始点上游除了含有真核生物启动子固有的TATA区和CAAT区外，启动子区域还包含1个防御胁迫响应元件(defense and stress responsive)、1个赤霉素响应元件(gibberellin responsive)、2个水杨酸响应元件(salicylic acid responsive)、4个茉莉酸甲酯响应元件(meja responsive)、7个脱落酸响应元件(abscisic acid responsive)和10个光周期响应元件(light responsive)。

表2 CsNAC032启动子区的顺式作用元件分布及功能

2.4 CsNAC032基因在不同器官中的表达模式

利用qRT-PCR检测基因在黄瓜不同器官中的表达情况，结果(图4)显示，在黄瓜子叶中相对表达水平最高，其次是根、果刺、茎、果皮、卷须中，在叶片、雄蕊、花瓣和雄蕊中表达水平较低。

2.5 CsNAC032基因在盐胁迫处理下的表达模式

用100 mmol/L的NaCl处理黄瓜幼苗，分别于处理后1、3、6、12、24 h通过qRT-PCR检测基因的表达水平，结果(图5)显示：在盐胁迫的3 h后，表达水平升高，并于处理后12 h表达水平达到最高，达到初始水平的10倍左右，说明可以响应盐胁迫的诱导。

3 讨论

本研究利用拟南芥的基因，通过同源克隆获得了其在黄瓜中的同源基因。编码区为900 bp，编码299个氨基酸，N端含有NAC家族蛋白典型的结构域，包含A、B、C、D、E 5个亚结构域。亚细胞定位预测CsNAC032主要在细胞核中发挥功能，进化树分析表明该蛋白与甜瓜的CmNAC-like(NP_001284423.1)亲缘关系最近。qRT-PCR检测基因在黄瓜不同器官中的表达情况，发现其在主要在根、茎、子叶、果刺等营养器官中表达，在雄蕊、雌蕊等生殖器官中相对表达水平较低，说明可能还参与了黄瓜营养器官的发育。

NAC是植物中广泛存在的一类转录因子，大量的NAC转录因子受生物和非生物胁迫诱导表达。在启动子上发现了多个响应激素信号通路和逆境胁迫的元件，如防御胁迫响应元件、赤霉素响应元件、水杨酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件和光周期响应元件，这些元件在黄瓜NAC家族基因启动子中相对保守，这与辣椒和玉米NAC基因的启动子元件分析结果类似。NAC基因可能通过这些元件受相应的信号诱导表达。

番茄的NAC转录因子受到HO、NaCl、聚乙二醇(PEG)的诱导表达，基因TRV干扰掉后，番茄的抗干旱能力显著下降。水稻的NAC家族膜结合转录因子在NaCl和42 ℃的高温处理后，表达量上调。利用CRISPR-Cas9技术编辑后，突变体对高温胁迫敏感，耐热能力减弱。在小麦中敲除会减弱植株的耐旱性，而该基因过表达后可以提高水分利用效率和增加胁迫响应基因的表达来显着增强小麦耐旱性。水稻的、番茄的、葡萄的均受到NaCl、ABA、干旱以及高温的诱导，进而调控下游基因以增强植物的抗逆能力。黄瓜受盐胁迫后，在叶片的表达水平显著上调，说明可能在黄瓜抵御盐胁迫中发挥着一定功能。

本研究利用拟南芥的基因，通过同源克隆获得了其在黄瓜中的同源基因。通过生物信息学方法对其序列以及表达进行了分析，推测可能响应盐胁迫。本研究为进一步研究其功能奠定了初步基础，但其胁迫响应机理有待进一步研究。