蛋白质组学在糖尿病视网膜病变炎性生物标志物研究中的应用

徐嫚鸿 综述 李筱荣 审校

天津医科大学眼科医院 天津医科大学眼视光学院 天津医科大学眼科研究所 国家眼耳鼻喉疾病临床医学研究中心天津市分中心 天津市视网膜功能与疾病重点实验室，天津 300384

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者常见的神经血管性并发症之一，其特征是视网膜血管渗漏、视网膜缺血、血管生成和视网膜炎症[1]。患者眼底表现为棉絮斑、渗出液、小静脉迂曲、动脉瘤和出血，可能导致视力下降、色觉丧失和夜视障碍[2]。DR是一种多系统、多因素相互作用的慢性疾病，炎症机制在其发病中发挥重要作用[3-4]。有研究者称DR为可防不可治盲，多数患者就诊时已发展至增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)阶段，需接受玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物或手术治疗，但经治疗患者的视力恢复情况并不理想，因此寻找更准确便捷的DR早期筛查手段显得尤为重要。

1996年Wilkins等[5]首次提出蛋白质组学的概念，即研究特定细胞、组织或生物体中所包含的全部蛋白质信息，包括蛋白质的表达水平、蛋白质的三维结构、翻译后修饰和蛋白与蛋白之间相互作用关系等，从而在蛋白质表达水平上全面而整体地揭示细胞代谢、疾病发生和发展等过程。泪液、房水、玻璃体液、视网膜下液和外周血清等与DR相关的生物流体样本通过蛋白质组学技术进行了大量的研究，不断有新的与DR中血管炎症相关的差异蛋白被深度挖掘，并作为DR诊断的生物标志物[6-7]。当血-视网膜屏障功能正常时，由活化的小胶质细胞和补体系统所导致的低度炎症水平在DR早期阶段起到维持内环境稳态平衡的作用[8]。随着疾病进展，活化的小胶质细胞、内皮细胞、大胶质细胞甚至神经元产生的炎性细胞因子水平增加并不断累积，不仅造成DR早期神经元细胞死亡，并且也在血管生成中发挥重要作用[9-10]。因此，本文就近年来蛋白质组学研究发现的DR相关炎性生物标志物作一综述。

1 蛋白质组学研究所涉及与DR相关的生物流体

生物流体指动物和人体内循环系统、呼吸系统等生理性流体，如血液、气体、尿液、淋巴液和其他体液[11]。眼部的不同组织和相关生物流体中蛋白质可反映眼科疾病的病理特征，DR患者反映疾病炎症状态的生物流体主要包括泪液、房水、玻璃体液和血浆。DR患者高血糖引起房水渗透压降低，进而影响房水蛋白水平改变[12]。玻璃体无血管，大部分玻璃体蛋白质来自视网膜，DR患者视网膜渗漏、出血、血-视网膜屏障受损均可导致玻璃体蛋白质成分和含量的变化[13-14]。糖尿病患者泪腺微血管损伤伴自主神经病变可能损害泪腺功能，其泪液蛋白的组成与健康人不同[15]。上述眼部生物流体通过毛细血管壁与血液以及通过直接和间接接触与各种眼组织不断交换物质，其中的蛋白质水平不仅有助于指示血管和/或眼组织的健康状态，也能作为潜在的疾病诊断和预后生物标志物[16]。

2 DR患者各生物流体中炎性相关蛋白变化

目前已有大量研究显示DR患者生物流体中存在有炎性相关蛋白表达变化，本小节根据DR相关的生物流体进行分类概述(图1)。

图1 DR患者各生物流体中炎性蛋白变化 NPDR：非增生性糖尿病视网膜病变；B2M：β-2微球蛋白；LCN：脂蛋白；PDR：增生性糖尿病视网膜病变；LF：乳铁蛋白；LACRT：催泪蛋白；LYSC：溶菌酶C；DR：糖尿病视网膜病变；AH：房水；APOA：载脂蛋白A；TF：转铁蛋白；KRT：角蛋白I型细胞骨架；CBS：胱硫醚β-合酶；MMP：基质金属蛋白酶；SEPP：硒蛋白P；CRP：C-反应蛋白；ICAM：细胞间黏附分子；TNF：肿瘤坏死因子；sVCAM：可溶性血管黏附分子；VCAM：血管黏附分子；CCL：C-C基序趋化因子；PEDF：色素上皮衍生因子；AZU1：炎症反应蛋白；VH：玻璃体液；LUM：细胞外基质蛋白多糖；KERA：角膜蛋白多糖；AGT：血管紧张素原；C3：补体蛋白C3；VEGF：血管内皮生长因子；AβA4：β淀粉样蛋白A4；TIMP：组织金属蛋白酶抑制剂；CLU：凝集素；CLSTN：钙结合蛋白；RBP：间皮受体视黄醇结合蛋白；SOD：细胞外超氧化物歧化酶；A2M：α2-巨球蛋白；CFH：补体因子H

2.1 泪液

泪液蛋白可反映眼部和全身系统性疾病病理特点，已成为近年来研究的热点[11]。与健康组泪液相比，非增生性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)患者泪液中β-2微球蛋白(beta-2 microglobulin，B2M)上调，脂蛋白1(lipocalin 1，LCN-1)及其前体明显下调[17]。B2M高表达可通过释放促炎细胞因子和活性氧代谢产物损害视网膜细胞[18]。脂蛋白是多种疾病的生物学标志物，如炎症性疾病、癌症、肝肾功能紊乱等，LCN-1很可能与DR患者炎症状态相关[19]。Wang等[20]采用基于光电珠的免疫传感技术检测到DR患者泪液中LCN-1的水平随DR严重程度增加而升高，提示泪液中LCN-1可能是DR的生物学标志物之一。Csösz等[21]通过对健康对照组、糖尿病组、NPDR组和PDR组患者的泪液样本进行蛋白质谱分析来识别DR生物标志物，其中PDR组乳铁蛋白和Ig-λ明显上调，可能与异常血管形成、视网膜出血和黄斑水肿引起的炎症相关。此外，Hagan等[22]利用乳铁蛋白、Ig-λ和该研究中的其他4个候选生物标志物LCN-1、催泪蛋白、溶菌酶C和亲脂素A建立了蛋白表达水平联合临床指标的视网膜疾病诊断模式。

2.2 房水

Chiang等[23]通过二维差异凝胶电泳法(2D-DIGE)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)方法共鉴定了11种与DR相关的差异表达蛋白质，这些差异表达蛋白参与多种生物学过程，包括炎症、视网膜血管微结构和细胞外基质的重组、血管生成、抗氧化和神经保护等，其中与炎症相关的差异表达蛋白包括载脂蛋白A-1(apolipoprotein，APOA-1)、血清转铁蛋白、角蛋白Ⅰ型细胞骨架10、基质金属蛋白酶13、硒蛋白P和胱硫醚β-合酶(cystathionine beta-synthase，CBS)。硒蛋白P维持体内氧化还原信号平衡，在DR患者的房水中显著下调[24]；CBS在DR患者房水中明显上调，该酶负责合成硫化氢，并与炎症和细胞凋亡相关[25]。研究表明CBS促进同型半胱氨酸的表达，进而激活视网膜和大脑中的小胶质细胞并诱导视网膜和大脑的炎症反应[26]。近期有研究采用液相色谱-质谱/质谱方法探讨PDR患者和对照组患者房水中差异表达的蛋白质，发现有10种与PDR相关，其中APOA-1、APOA-2和APOA-4与PDR的炎症反应密切相关[27]，提示促炎细胞因子可能通过脉管系统或玻璃体进入房水，同时这些促炎细胞因子也可作为PDR患者房水中的生物标志物。

2.3 玻璃体

玻璃体中一些蛋白的差异表达可以反映DR不同阶段病理改变，包括VEGF、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)和人源性激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)等。有研究运用三联四极杆液相色谱-质谱/质谱多反应监测模式，发现NPDR患者玻璃体中kallistatin的表达水平明显高于黄斑裂孔患者[28]。在db/db小鼠诱导的糖尿病模型中，玻璃体腔过表达kallistatin可通过抗氧化、抗炎和抗纤维化等作用保护视网膜免受损伤[29]。

Loukovaara等[30]进行了大规模的蛋白质组学研究，使用非标记液相色谱-质谱/质谱方法收集138份玻璃体液样本，结果显示与NPDR患者相比，PDR患者玻璃体液中细胞外基质蛋白多糖和角膜蛋白多糖表达上调，这2个蛋白可能介导PDR炎症反应中趋化因子的募集过程，也是区别NPDR和PDR患者的玻璃体液生物标志物。此外，多项研究均证实炎症急性反应期的组分如α-1-抗胰蛋白酶，白细胞介素，补体系统如C3，凝血途径如纤维蛋白原、凝血酶原和其他炎症途径如VEGF、β淀粉样蛋白A4、组织金属蛋白酶抑制剂1均与PDR具有相关性[1，27，30-31]。作为炎症过程的负调节因子，DR患者玻璃体液中PEDF水平较对照组低，这表明在DR的病理过程中不仅促炎细胞因子增加，且平衡抗炎蛋白减少[32]。凝集素是一种参与补体级联调节的蛋白质，在血-视网膜屏障的抗炎保护作用中发挥重要作用，与PDR相比，凝集素在对照组中呈高表达水平；体内实验也证明凝集素可降低视网膜屏障损伤，提高早期DR大鼠抗凋亡能力从而保护视网膜神经免受损伤[33]。Gao等[34]在PDR患者玻璃体液中发现血管紧张素原上调和钙结合蛋白-1、间皮受体视黄醇结合蛋白、细胞外超氧化物歧化酶3和PEDF下调，这些差异表达的蛋白均可作为生物标志物，提示PDR可能发生或进展。

2.4 血浆

DR是糖尿病的微血管并发症，其病理过程中蛋白质组变化在全身循环中较为明显。血浆是最常规的样本类型，DR患者在接受手术治疗时，其血浆样本相对更容易获得[35]。血浆样本中已报道许多与DR发病相关的蛋白，是DR的潜在生物标志物，如丝氨酸蛋白酶抑制因子2、C-反应蛋白、C-C基序趋化因子5、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、白细胞介素6、戊聚糖相关蛋白3、PEDF、纤溶酶原激活物抑制剂1，血清淀粉样蛋白、趋化因子CXCL12、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、可溶性VCAM-1和VEGF[36-38]。ICAM-1是核因子-κB信号通路的下游基因之一，视网膜中ICAM-1表达增加与视网膜中白细胞增多相关，TNF-α触发视网膜血管内皮细胞炎症反应，内皮细胞中ICAM-1表达水平明显增加。体内实验结果表明链脲佐菌素诱导的DR模型第11个月和第15个月，降低小鼠血浆ICAM-1水平则可明显减少视网膜白细胞黏附[39]。糖尿病患者血浆中炎症反应蛋白(azurocidin，AZU1)明显升高，其升高水平在糖尿病并发症包括DR患者中尤为明显。在血管内皮细胞受到炎症刺激时，AZU1由中性粒细胞释放，提示其在调节视网膜血管通透性中起作用[40]。

Kim等[40]通过蛋白质谱的方法分析NPDR患者与未发生视网膜病变的糖尿病患者的血浆和玻璃体液，共鉴定出27个存在差异表达的蛋白，进一步通过多反应监测方法发现，APOA-1、α2-巨球蛋白、补体因子H和凝血酶原等蛋白可能是引发视网膜炎症反应的关键因子；此外，将维生素E结合蛋白、载脂蛋白C-Ⅲ、补体因子B和kallistatin作为联合生物标志物用于诊断DR，其准确率可达85%～100%。另一项蛋白质组学研究表明，和健康对照组相比，PDR患者血清α1-糖蛋白水平升高，而α-酸糖蛋白和APOA-1水平降低[41]。此外，也有研究者发现DR患者血浆中有5种高表达的炎性蛋白CRP、ICAM-1、可溶性糖蛋白130、TNF受体Ⅰ和VCAM-1，其中任1种蛋白在血浆中的高水平表达均能显著增加DR的患病风险[42]，提示这5种蛋白均可作为DR的生物标志物。

3 蛋白质组学在DR研究中的问题和局限性

蛋白质组学检测样本收集方面，泪液取样是生物流体样本收集中侵入性最小的方法，但收集足够用于蛋白质组学检测的泪液仍存在一定难度。同时，部分合并干眼的患者泪液分泌明显减少，进一步增加取样难度。此外，泪液所含蛋白量较少，其中检测到的差异蛋白对于DR疾病分期和预后的意义仍有待证明。DR视网膜血管渗漏导致房水和玻璃体液中蛋白水平发生改变，能够较好地反映视网膜疾病的进程并具有指导疾病治疗和提示预后的作用，但房水和玻璃体液样本的获取多为有创性操作，很难从健康人人体取材，因而缺乏健康对照。血浆样本是常规的临床检测样本，但在研究以糖尿病为基础疾病的视网膜病变时，血浆中差异表达的蛋白不仅提示视网膜的病理改变，也能体现糖尿病其他脏器并发症的严重程度。因此，在使用蛋白质组学方法进行研究时，可考虑采集多维度样本信息，从而更全面、综合地分析与疾病真正密切相关的蛋白信息。

蛋白质组学检测过程中，各生物样本中高丰度蛋白质会影响甚至掩盖低丰度差异表达蛋白的检测，容易导致关键差异表达蛋白的丢失[31]。

蛋白质组学检测结果分析过程中，存在着大数据分析的共有难题。大规模蛋白质组学分析的主要局限性在于很难获取足够数量和体积的样本[43]，过去的大部分研究，特别是探索性的蛋白质组学研究，样本量相对较小，结果重现性较差。随着一些新型蛋白质组学技术的发展，如数据非依赖性采集模式，蛋白质组学研究在通量、重现性和灵敏度方面有所改善。目前，越来越多的研究不断细化疾病的分组和分型，如将NPDR患者按照病程长短、眼底表现差异等进一步细化亚组分型，而随着检测组数目的增加，具体哪2个组之间的差异蛋白更能反映疾病的病变情况还需要研究者不断探索。

蛋白质组学结果分析和讨论的过程中也存在有很大的困难。研究所发现的差异蛋白并不一定是与疾病发病机制高度相关的关键蛋白。此外，不同生物学液体的检测结果也存在矛盾的情况，如PDR患者玻璃体液样本中PEDF水平显著降低，但其外周血中PEDF表达水平显著升高[44]。因此蛋白质组学结果需要研究者进一步验证。

4 蛋白质组学在DR研究中的应用前景

对DR患者的生物流体进行蛋白质组学研究有助于提高对DR发病机制的认识。随着高通量蛋白分析技术的不断改进，这些研究在发现DR生物标志物和识别新的治疗靶点方面具有巨大潜力。此外，蛋白质组学的研究范围也逐步扩展至检测蛋白质翻译后修饰的水平，使研究者能够评估蛋白的糖基化、磷酸化和乙酰化状态，为DR的蛋白质组差异提供更多功能背景。最重要的是，蛋白质组学与其他组学分析相结合成为筛选新型治疗药物、评判治疗效果的新手段。总之，高通量蛋白质组学分析为DR的诊断、预后和治疗检测以及开发新疗法提供了新的方法。

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