水杨酸和2, 1, 3-苯并噻二唑诱导烟草抗赤星病的效应研究

张文梅，欧阳冬梅，颜牛生，肖刘华，王印宝，向妙莲*

水杨酸和2, 1, 3-苯并噻二唑诱导烟草抗赤星病的效应研究

张文梅1，欧阳冬梅2，颜牛生3，肖刘华4，王印宝4，向妙莲4*

（1. 抚州市烟草公司广昌分公司，江西 广昌 344900；2. 宜春市农业农村局，江西 宜春 336000；3. 萍乡市莲花县农业农村局，江西 莲花 337100；4. 江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045）

【目的】为探索外源物质水杨酸（salicylic acid，SA）和2, 1, 3-苯并噻二唑（2, 1, 3-Benzothiadiazole，BTH）诱导烟草抗赤星病的效应。【方法】选用红花大金元烟草幼苗为试验材料，分别用0.25～2.0 mmol/L SA和0.1～2.0 mmol/L BTH喷施烟草幼苗，48 h后接种赤星病菌（），测定病斑直径以筛选SA和BTH诱导烟草抗赤星病的最适浓度。基于此，用上述最佳诱导浓度SA和BTH预处理烟草叶片后接种赤星病菌，测定烟草幼苗叶片过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶的活性以及丙二醛（MDA）含量。【结果】0.5～2.0 mmol/L SA预处理烟草幼苗，其病斑直径均明显低于对照组，其中2.0 mmol/L SA处理的诱导效果最佳为23.01%；0.1～0.5 mmol/LBTH可有效降低烟草病斑直径，以0.2 mmol/L BTH的诱导效果最佳，为22.43%；最佳诱导浓度SA和BTH处理组的CAT、POD和PPO防御酶活性在接种后15 d内显著高于对照组，而MDA含量则低于对照组，表明外源SA和BTH对赤星病的诱导抗性作用，可能与其提高烟草防御酶活性并降低MDA含量有关。【意义】上述研究将为烟草赤星病防控提供理论参考。

水杨酸；2, 1, 3-苯并噻二唑；烟草赤星病；诱导抗病；防御酶

【研究意义】链格孢属是重要的植物病原菌[1]，其孢子种类多样，已有报道该病原菌可引起黄瓜叶斑病、梨黑斑病和柑橘黑腐病等多种植物发病[2-4]，影响果实品质，降低产量，造成严重经济损失，给农林作物带来巨大的危害。由链格孢菌（）引起的烟草赤星病是危害烟草的重要病害之一[5]，该病具有潜育期短、流行范围广、暴发速度快和危害程度大等特点，严重影响烟叶的产量与品质。【前人研究进展】水杨酸（salicylic acid，SA），即邻羟基苯甲酸，是一种植物体内重要的调节物质，其与植株生长发育以及抵御不良生物及非生物因子密切相关，在植物体内发挥重要的信号传导作用[6]。当植物遭受病原物侵染后，体内SA急剧增加，可激发寄主植物提高免疫反应[7]。前人研究表明，外源SA处理可以提高对大豆孢囊线虫[8]、芒果炭疽病[9]和库尔勒香梨黑头病[10]等抗性。2, 1, 3-苯并噻二唑（2, 1, 3-Benzothiadiazole，BTH）是一种非生物源植物抗病激活剂。外源BTH处理，可激发植物免疫系统从而诱导植物产生具有广谱性和持久性的系统获得抗性，诱导植物对苹果青霉病和烟草青枯病等真菌和细菌病原物产生广谱抗性[11-13]。

【本研究切入点】目前对烟草赤星病主要采用化学防治的方法，如蔡梁等[14]和陈玉国等[15]试验表明56%啶酰·肟菌酯及15%多抗霉素可湿性粉剂等杀菌剂对烟草赤星病有较好的抑制作用。此外，亦有报道显示利用中草药提取物质和生防菌哈茨木霉等可显著诱导烟草抗赤星病[16-17]。但有关SA和BTH诱导烟草抗赤星病的效应及其与相关防御酶活性的关系研究较少。【拟解决的关键问题】本研究以烟草幼苗（红花大金元）为试验材料，通过外源SA和BTH处理，探究SA和BTH诱导烟草植株抗赤星病的效应与相关防御酶活性的关系，以期为烟草赤星病的防治提供参考。

1　材料与方法

1.1　供试材料

烟草催芽包衣种子（红花大金元）：来自玉溪中烟种子有限责任公司。试验前于育苗温室（28±1℃）培养，十字期待用。

链格孢菌（）：江西农业大学农学院植物病理实验室提供。

抗病诱导剂：水杨酸（SA）购自天津市大茂化学试剂厂，2, 1, 3-苯并噻二唑（BTH）购自北京索莱宝科技有限公司，试验前用蒸馏水定容至试验所需浓度，待用。

1.2　试验方法

1.2.1不同浓度SA和BTH处理诱导烟草抗赤星病效应取1.1中烟草幼苗，分别用0.25，0.50，0.75，1.0，2.0 mmol/L SA和0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mmol/L BTH叶面喷施幼苗叶片，每株喷施15 mL，以蒸馏水处理为对照，每处理3次重复，每重复6株烟草。48 h后，用无菌接种针在烟草叶片正面刺伤小孔，接种10mL浓度为1.0×106conidia/mL的孢子悬浮液，接种后置发病室（温度28 ℃，相对湿度95%），逐日测定病斑直径。按以下公式计算诱导效果，筛选最佳诱导抗病浓度。

诱导效果=（对照组病斑直径-处理组病斑直径）/对照组病斑直径×100%（1）

方法同上，以最佳诱导浓度的SA和BTH喷施烟草幼苗并接种，分别于接种后0，3，6，9，12，15 d取病健交界处组织（2 cm），加入液氮冷冻后迅速研磨成粉末状，装入取样袋，于-80 ℃条件下保存备用。

1.2.2抗病相关指标测定取1.2.1样品，测定烟草幼苗叶片过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等抗病相关防御酶活性以及丙二醛（MDA）含量。

POD测定方法：采用愈创木酚法[18]。取一支试管，向试管中加入1.2.1中烟草样品0.15 g，快速研磨之后转移至10 mL离心管中，加入2.0 mL含有1 mmol聚乙二醇6 000（PEG）、4%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）和1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的pH为5.5乙酸-乙酸钠缓冲液，于漩涡混合器上混合均匀，均匀后于4 ℃，1 200 r/min离心30 min，取上清液备用。取上清液0.5 mL，25 mmol/L愈创木酚溶液3.0 mL以及0.5 mol/L过氧化氢溶液200 µL，将反应混合液放入石英比色皿中用分光光度计法测得样品在波长470 nm下的吸光度，单位为ΔOD470/(min·g)。POD活性的计算公式为：

U=（ΔOD470×）/（×）（2）

式（2）中：烟草样品提取液总体积，mL；：测定时所取烟草样品提取液体积，mL；：烟草样品质量，g。

PPO测定方法：采用邻苯二酚法[18]。上清液制备同POD；取上清液100 µL，加入50 mmol/L邻苯二酚溶液1.0 mL以及50 mmol/L、pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液4.0 mL，将这些反应混合液放入石英比色皿中测得样品在波长为420 nm下的吸光度，单位是ΔOD420/(min·g)。PPO活性的计算公式为：

U=（ΔOD420×）/（×）（3）

式（3）中：烟草样品提取液总体积，mL；：测定时所取烟草样品提取液的体积，mL；：烟草样品质量，g。

CAT测定方法[18]：取一支试管置冰浴条件，称取1.2.1中烟叶样品0.15 g，加50 mmol/L、pH为7.5磷酸缓冲液5 mL，置漩涡混合器上混合均匀，于4 ℃、9 500 r/min离心20 min。取上清液0.1 mL，加入20 mmol/L过氧化氢溶液2.9 mL制成混合液放入石英比色皿中，测定样品在波长240 nm的吸光度。单位为ΔOD240/(min·g)。CAT活性的计算公式为：

U=（ΔOD240×）/（0.01××）（4）

式（4）中：烟草样品提取液总体积，mL；：测定时所取烟草样品提取液的体积，mL；：烟草样品质量，g。

MDA含量测定[18]：取1.2.1中的烟草样品0.15 g放入试管中，于冰浴条件下加入7 mL 100 g/L三氯乙酸（TCA）溶液，将试管中的混合液放在漩涡混合器中混合均匀，之后于4 ℃，9 500 r/min离心20 min；取上清液2.0 mL，加入0.67% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液2 mL，混合均匀后沸水煮20 min，迅速冷却后4 000 r/min离心15 min。取上清液，测定上清液分别在450，532，600 nm波长处的OD值，并以0.67%的TBA溶液为空白对照。按下式计算MDA含量：

MDA（mmol/g）=[6.452×（A532-A600）-0.559×A450]×[/（×）]（5）

式（5）中：烟草样品提取液总体积，mL；：测定时所取烟草样品提取液的体积，mL；：烟草样品质量，g。

1.3　数据处理

试验数据的统计分析方法采用Excel 2016和SPSS17.0，并用Duncan’s新复极差法进行多重比较，处理的显著水平<0.05。

2　结果与分析

2.1　不同浓度SA和BTH处理诱导烟草抗赤星病效应

如表1所示，0.25～2.0 mmol/L浓度SA处理烟草叶片，除0.25 mmol/L SA处理组病斑直径与对照无显著差异外（<0.05），其它4组浓度SA处理可显著降低烟草幼苗赤星病病斑直径。当SA浓度为2.0 mmol/L时，诱导效果达最高值，为23.01%；当0.1～0.5 mmol/L浓度BTH可显著诱导烟草抗赤星病，其中BTH浓度为0.2 mmol/L时，最佳诱导效果达22.43%（<0.05），但当浓度升高至1.0～2.0 mmol/L时，其病斑直径反而大于对照组直径，BTH对烟草诱导抗赤星病表现为负调控。

表1　不同浓度SA和BTH预处理诱导烟草幼苗抗赤星病的效应

表中数据代表试验结果3次重复的平均值±标准误。同列数据之间互相比较，不同字母表示处理之间在<0.05水平差异显著。

2.2　SA和BTH诱导烟草抗赤星病的持续效应

由图1A可知，用SA最佳诱导浓度2.0 mmol/L处理烟草幼苗，其病斑直径在接种后3～15 d均明显小于对照组病斑直径；接种后12 d，SA诱导效果最佳为28.6%（图1B），显著高于其它接种后时间点（<0.05）。0.2 mmol/L BTH处理烟草幼苗，接种后15 d，BTH处理病斑直径均显著小于对照组（图1A）；图1B显示接种后3～15 d，BTH对烟草幼苗的诱导效应随时间变化先上升后下降，在9 d时出现峰值，诱导效果为24.89%。

A：SA和BTH处理接种A. alternate后15 d，烟草叶片病斑直径；B：SA和BTH处理诱导烟草叶片抗赤星病的效应；不同字母表示差异显著（P<0.05）。

2.3　SA和BTH处理对烟草幼苗防御酶活性和MDA含量的影响

如图2A所示，除接种后3 d，两处理组的CAT活性均显著高于对照组，其中接种后5 d，SA处理组和BTH处理组的CAT活性分别为对照组的1.94倍和1.27倍。SA和BTH处理后接种烟草叶片POD活性如图2B。接种后15 d内，处理组POD活性始终高于对照组，在接种后的15 d，SA和BTH处理组POD活性达到最大值，分别为对照组的1.81倍和1.89倍（<0.05）。图2C中，SA和BTH处理组PPO活性于接种后9 d达最大值，依次为对照组的2.37倍和1.54倍。相反，由图2D所示，SA和BTH处理后烟草叶片MDA含量在接种后15 d内，除9 d外均低于对照组。

3　讨　论

外源SA和BTH对大多数植物的生理作用具有“低促高抑”双重性，因其施用浓度和器官种类不同，既有促进效应又有抑制效应。本研究结果表明，0.25～2.0 mmol/L SA和0.1～2.0 mmol/L BTH预处理烟草幼苗，SA对其诱导效应随浓度升高而增强，BTH则在浓度为0.2 mmol/L时诱导效应达到最高值，但当浓度继续升高反而促进发病，上述SA和BTH在其浓度范围内效应不尽相同，说明不同外源诱导剂的最佳诱导效应因其种类不同而各异。就SA而言，在0.25～2.0 mmol/L范围内，SA诱导效应随浓度升高不断增强，暗示SA低促高抑现象在上述浓度范围内尚无表现效应转折点，或者SA诱导烟草抗赤星病亦可能没有浓度效应。反之，BTH在0.1～2.0 mmol/L则表现明显的双重效应：当浓度为0.2 mmol/L时，诱导效果达最高值，然后随浓度升高逐渐下降；当浓度升高至2.0 mmol/L时，反而促进烟草赤星病的发生，上述结果与张广旭[19]和刘晓佳等[20]试验结果类似。说明不同外源物质诱导不同寄主抵御不同病害其最适浓度不尽相同，可能与外源物质-寄主-病原互作模式有关。

POD是酚类、植保素合成的重要酶，同时具有清除超氧阴离子自由基的作用；CAT和PPO与植物的代谢强度及抗病能力密切有关，两者均可分解细胞内的过氧化氢避免细胞受到毒害，提高防御能力；植物组织细胞膜受损程度与组织中积累的MDA含量相关，病原菌侵染会导致植物组织中MDA含量明显上升，MDA含量则可以反映逆境对植物细胞造成的损伤程度[21]。植物在遭受逆境胁迫时，为保持组织内活性氧代谢平衡，采取调节CAT、POD、PPO等抗氧化酶活性和MDA含量的方式，来减缓细胞内活性氧自由基积累及膜脂过氧化带来的伤害[22]。许倩倩[23]研究表明，0.5 mmol/L SA和0.5 mmol/L BTH能有效提高甘蓝幼苗抗氧化酶活性及降低MDA含量，提高幼苗对根肿病的抗性。本试验结果表明采用外源2.0 mmol/LSA和0.2 mmol/L BTH喷施处理烟草接种赤星病菌后，处理组CAT、POD、PPO等抗氧化酶的活性高于对照，表明外源SA和BTH可通过提高植物组织中活性氧化酶活性和减少MDA对植株造成的伤害，从而提高植株的抗病性，与耿莉娜等[24]在不同品种烟草接种赤星病菌后防御酶活性变化的研究结果一致。

综上所述，外源SA和BTH预处理烟草幼苗赤星病病，可能通过调控防御酶活性，减轻MDA积累，延缓膜脂过氧化，从而缓解病害的发生。有关SA和BTH诱导烟草幼苗抗赤星病的分子机制有待后续研究。

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Effects of Salicylic Acid and 2, 1, 3-Benzothiadiazole Inducing Tobacco Against Brown Spot

ZHANG Wenmei1, OUYANG Dongmei2, YAN Niusheng3, XIAO Liuhua4, WANG Yinbao4, XIANG Miaolian4*

（1.Guangchang Branch of Fuzhou Tobacco Company, Guangchang, Jiangxi 344900, China; 2. Yichun Bureau of Agricultural and Rural Affairs, Yichun, Jiangxi 336000, China; 3. Lianhua Bureau of Agricultural and Rural Affairs, Lianhua, Jiangxi 337100, China; 4. School of Agronomy Sciences, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China）

In this study, tobacco seedlings were used to investigate the effects of salicylic acid (SA) and 2, 1, 3-Benzothiadiazole (BTH) inducing resistance to brown spot.Tobacco seedlings were sprayed with 0.25～2.0 mmol/L SA and 0.1～2.0 mmol/LBTH, respectively, and inoculated with48 h later, and then the lesion diameters was determined to get the optimum concentrations of SA and BTH. Based on this, the defense enzyme activities of seedlings, including catalase (CAT), peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO) were measured after being treated with the optimum induction concentrations of SA and BTH.The results showed that the lesion diameters of tobacco leaves treated with 0.5～2.0 mmol/L SA and 0.1～0.5 mmol/L BTH were all smaller than that of the control group, and the best induced effect was 23.01% (2.0 mmol/L SA) and 22.43% (0.2 mmol/L BTH), respectively. Compared with the control, the activities of CAT, POD and PPO were mostly significantly enhanced while the MDA content was reduced within 15 days after inoculation. It was indicated that the induced resistance of exogenous SA and BTH to brown spots may be related to the increase of defense enzyme activity and the decrease of MDA content in tobacco.This study provided theoretical references for the control over tobacco brown spots.

salicylic acid; 2, 1, 3-Benzothiadiazole; tobacco brown spot; induced disease resistance; defense enzymes

S435.72

A

2095-3704（2022）03-0318-06

张文梅, 欧阳冬梅, 颜牛生, 等. 水杨酸和2, 1, 3-苯并噻二唑诱导烟草抗赤星病的效应研究[J]. 生物灾害科学, 2022, 45(3): 318-323.

10.3969/j.issn.2095-3704.2022.03.52

2022-07-07

2022-08-16

江西省自然科学基金项目（20192BAB204018）

张文梅（1985—），女，硕士，主要从事烟草病虫害防治，zhwmly@163.com；*通信作者：向妙莲，副教授，博士，mlxiang@jxau.edu.cn。