华北平原春玉米多熟种植模式对土壤真菌群落的影响*

陈兴琼, 李金娜, 国一凡, 陈 琳, 徐 洁, 隋 鹏, 刘 瑾, 高旺盛, 陈源泉

(中国农业大学农学院 北京 100193)

华北平原作为我国粮食主产区之一, 对保障我国粮食安全有重要意义。但是, 华北平原以冬小麦(L.)-夏玉米(L.)为主的一年两熟种植制度存在对地下水消耗大、化肥投入过量等不可持续问题。探索新型种植制度是该区域农业绿色转型发展的重要途径。近年来, 春玉米一年1熟制由于与降水时空分布耦合度高、具有降低水肥消耗等优势而成为学界研究热点。但春玉米1熟也存在土地休闲期较长, 不利于土地资源高效利用的问题。因此, 本课题组选择在华北平原种植面积较广、适应性较强的作物与春玉米构成多熟种植模式, 试图筛选出节水高效且能有效保护地力的新型种植模式。本文在前期研究的基础上,在耕地保护的战略背景下, 以土壤微生物为重点, 研究不同种植模式对土壤质量的影响。

土壤微生物是反映土壤健康状况的重要指标,通过腐解作物残茬影响土壤有机质数量和组成, 参与土壤多种物质循环过程。而土壤真菌作为土壤微生物区系的重要成员, 是植被参与生态系统循环的重要推动者, 在分解土壤有机质, 为植物提供养分方面有重要作用。有研究发现, 种植模式通过影响土壤环境因子调控真菌群落结构和多样性, 种植结构调整既影响土壤氮素、磷素及有机质等养分转化过程, 又影响土壤容重、含水量、孔隙度及团聚体稳定性等物理性质。合理的种植制度能够发挥种间相互作用, 从而优化土壤菌群, 提高土壤有益真菌菌群丰度, 改善土壤结构, 提高土壤质量, 促进农业可持续发展。目前, 对于华北地区不同种植模式下水分利用效率、土壤理化性质、温室气体排放等研究方面较多, 对土壤微生物群落结构研究较少, 有待进一步探讨。

本试验从微生物的角度, 利用Illumina高通量测序和FUNGuild功能预测研究方法, 对6种以春玉米为主的种植模式下土壤真菌群落组成、物种差异、营养方式和真菌群落对于土壤理化性质的响应进行分析, 试图探明不同种植模式下土壤真菌群落结构组成差异及菌群与环境因子的响应关系, 为华北平原可持续农业发展模式提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验区概况

试验开始于2014年, 位于河北省中国农业大学吴桥实验站(37°41′N, 116°37′E)。该地区气候类型为温带季风气候, 日均温13.97 ℃, 年均降水量543.05 mm(2014-2020年), 年均日照时数2431.91 h, 无霜期201 d, 土壤类型为砂壤土, 2014年0～20 cm耕层土壤pH 8.56, 有机质含量11.04 g·kg, 全氮含量0.95 g·kg,速效磷含量41.65 mg·kg, 速效钾含量225.42 mg·kg。本试验的气候数据来自吴桥县气象局, 土壤基础理化数据来自于试验实测。

1.2 试验设计

试验采用完全随机区组设计, 选取当地适应性较强的种植模式, 共设置6个处理: 对照模式为春玉米单作(MM); 复种模式3种, 分别为冬小麦-夏玉米(MW)、菠菜(L.)-春玉 米(MSp)、黑麦(L.)-春玉米(MR); 套作模式2种, 分别为马铃薯(L.)/春玉米(MPo)、豌豆(L.)/春玉米(MP)。每个处理设3个重复, 共18个小区, 小区面积63 m(7 m×9 m)。

试验中, 春玉米品种为‘良玉99’, 夏玉米品种为‘郑单958’, 玉米株距30 cm, 单作和复种模式中, 玉米行间距为60 cm, 套作模式中玉米行间距为40 cm,播种深度5 cm。小麦品种为‘济麦22’, 采用条播的播种方式, 行间距20 cm, 播种量300 kg·hm。菠菜品种采用当地品种, 撒播, 播种量75 kg·hm。黑麦品种为‘冬牧70’, 条播, 行间距20 cm, 播种量112.5 kg·hm。马铃薯品种为‘荷兰15’, 穴播, 起垄覆膜, 行间距40 cm, 穴距30 cm。豌豆品种为‘中豌6号’, 穴播, 大小行种植, 小行间距20 cm, 大行间距60 cm, 播种量60 kg·hm。采用常规施肥管理, 2019—2020轮作年各模式投入及作物产量如表1所示。

表1 不同春玉米多熟种植模式的投入及作物产量Table 1 Input and yields of different treatments of multiple cropping systems based on spring maize

1.3 样品采集与测定

本研究分析的土样采集于2020年9月春玉米收获期, 每小区采用五点法采集0～20 cm耕层土样, 同小区混合形成一个土样, 于冰盒中带回实验室, 迅速剔除土样中的植物根茎和其他杂质。取一部分用无菌管储存置-80 ℃保存以备后续土壤真菌多样性测定, 另一部分自然风干用于土壤理化性质的测定。

土壤理化性质主要测定了土壤容重(BD)、田间持水量(FC)、水稳性团聚体平均重量直径(MWD)、全氮(TN)、有机质(SOM)、速效磷(AP)、速效钾(AK)及pH共8个土壤理化指标。测定方法参考 《土壤农化分析》, 具体方法如下: 采用环刀法进行土壤容重和田间持水量的测定, 湿筛法测定水稳性团聚体平均重量直径(MWD), 凯氏定氮法测定土壤全氮含量, 重铬酸钾外加热法测定土壤有机碳含量(土壤有机质含量=有机碳含量×1.724), 钼锑抗比色法测定土壤速效磷含量, 醋酸铵浸提-火焰光度法测定土壤速效钾含量, 水浸电位法(1∶2.5)测定土壤pH。

土壤真菌群落多样性测定。对6个处理的共18个土壤样本进行DNA 抽提, 使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取, 使用NanoDrop2000测定DNA 浓度和纯度。真菌PCR扩增引物为ITS1F (5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3)和ITS2R(5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3), 扩增程序如下: 95 ℃预变性3 min, 27个循环(95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s), 然后72 ℃稳定延伸10 min, 最后在4 ℃进行保存。将同一样本的PCR产物混合后, 使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物, 经过产物纯化、检测定量、建库, 利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序, 获取的样本序列按照最小样本序列数进行抽平处理。微生物测序由上海美吉生物医药科技有限公司提供技术支持。

1.4 统计分析

Illumina Miseq测序过程中, 首先使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.20.0)软件对原始测序序列进行质控, 然后通过FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash, version 1.2.7)软件进行拼接, 再使用UPARSE软件(http://drive5.com/uparse/, version 7.1), 根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/, version 2.2)对每条序列进行物种分类注释, 比对nuite数据库, 设置比对阈值为70%。使用R语言(version 3.3.1)工具进行真菌多样性及群落组成数据统计和作图。基于目前已发表的文献或权威网站数据, 通过生物信息学方法将真菌物种分类与功能分类联系起来, 从而对真菌进行FUNGuild功能预测。试验数据通过SPSS statistics 26进行整理分析。

在真菌α多样性指数分析中, 主要对覆盖度指数(Coverage指数)、丰富度指数(Chao1和Ace指数)及多样性指数(Shannon和Simpson指数)进行分析, 各指数具体计算方法如下:

根据公式(1)进行Coverage指数计算:

式中:表示Coverage指数值,表示只含有一条序列的OTU数目,表示抽样中出现的总序列数目。

根据公式(2)进行Chao 1指数计算:

式中:表示Chao 1指数值,表示实际观测到的OTU数目,表示只含有一条序列的OTU数目,表示只含有2条序列的OTU数目。

根据公式(3)-(6)进行Ace指数计算:

式中:表示Ace指数值;n表示含有条序列的OTU数目;表示含有或少于abund条序列的OTU数目;表示多于abund条序列的OTU数目;abund表示优势OTU的阈值, 默认为10。

根据公式(8)进行Shannon指数计算:

式中:表示Shannon指数值,表示实际观测到的OTU数目,n表示第个OTU所包含的序列数,表示所有的序列数。

根据公式(8)进行Simpson指数计算:

式中:表示Simpson指数值。

在真菌β多样性分析中, 采用weighted-unifrac距离算法, 通过各物种属水平的系统进化树, 计算进化树各物种的系统发育进化关系, 并将序列的丰度信息进行加权计算, 从而计算样本间的距离。采用ANOSIM非参数相似性检验, 以检验组间差异是否大于组内差异, 并计算值, 计算方式如公式(9)所示:

2 结果与分析

2.1 不同种植模式的土壤真菌多样性

对微生物α多样性进行分析, 结果显示不同种植模式土壤真菌OTU数目、Ace指数及Chao1指数均无显著性差异, 但MR处理的土壤真菌OTU数目及丰富度指数(Ace及Chao1指数)均高于其他模式(表2)。轮、套作模式的多样性指数显著高于MM(＜0.05)。相比于春玉米单作(MM), 有其他作物加入的模式能够提高土壤真菌多样性。Shannon指数表现出: MR＞MW＞MPo＞MSp＞MP＞MM, 多熟种植模式分别较MM提高12.18%、12.17%、11.69%、10.37%及8.44%。

表2 不同春玉米多熟种植模式土壤真菌测序结果及α多样性指数Table 2 Sequencing results and α diversity indexes of soil fungi in different treatments of multiple cropping systems based on spring maize

本试验以主坐标分析(PcoA)的方式, 进行土壤真菌群落β多样性分析(图1)以说明各模式样本间的差异。ANOSIM检验结果=0.3877, 说明处理组间差异大于处理组内差异, 数据分析可信。PcoA坐标显示, PC1轴和PC2轴分别可以解释31.14%和22.77%的群落组成差异。相同处理间样本点相对聚集, 不同处理间样本点相对分散。说明不同种植模式下土壤微生物群落多样性存在差异。主要表现为MM处理各样点集中分布在PC1轴的正轴区域, 其他种植模式主要分布于零点及PC1轴负轴区域, 与MM距离相对较远且相对聚集, 其他种植模式间群落相似性高而与春玉米单作模式群落差异较大。

图1 不同春玉米多熟种植模式的土壤真菌群落差异分析(属水平)Fig. 1 Analysis of differences of soil fungi of multiple cropping systems based on spring maize (on genus level)

2.2 不同种植模式的土壤真菌群落组成

各模式土壤真菌群落组成表明(图2A）, 主要真菌门为子囊菌门(Ascomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和隐菌门(Rozellomycota), 相对丰度分别为76.42%～85.58%、8.50%～13.82%、1.94%～4.88%、0.48%～3.69%和0.01%～2.32%。子囊菌门在各模式土壤中占据绝对优势, 在各处理中平均相对丰度达80.29%, 且在各模式中分布较为均匀, 无显著性差异。与MM相比, 多熟种植模式显著影响了土壤被孢霉门的相对丰度, 除MP外, 其他轮套作模式中被孢霉门相对丰度均高于MM, 且MR处理具有相对突出的优势。由此看来, 土壤相对丰度较低的真菌群落更容易受种植模式的影响。通过对不同处理土壤真菌群落属水平组成情况分析(图2B), 共注释到411个真菌属, 其中核心共有真菌属为151个, 主要包括被孢霉属(,11.18%)、绿僵菌属(, 10.99%)、拟棘壳孢属(, 8.42%)、赤霉菌属(, 7.43%)及(4.52%)等。共有真菌属大多是真菌属水平的优势真菌属, 在土壤中占比较大(图2C)。特有真菌属共103个, 占真菌属总数的25.06%, 其中MR处理特有真菌属相对丰富, 占土壤真菌属总数的7.30%,占特有真菌属总数的29.13%。其他各模式中, MP分布特有真菌属18个, MPo分布特有真菌属16个,MM分布特有真菌属15个, MW分布特有真菌属13个, MSp分布特有真菌属11个, 分别占特有真菌属总数的17.48%、15.53%、14.56%、12.62%和10.68%。

图2 不同春玉米多熟种植模式的土壤真菌群落组成Fig. 2 Soil fungal community composition of multiple cropping systems based on spring maize

2.3 不同种植模式的土壤真菌物种差异

土壤真菌属水平样本差异如图3所示。土壤真菌相对丰度前10的真菌属中被孢霉属、绿僵菌属、拟棘壳孢属及裂壳属 ()受种植模式的显著性影响(＜0.05)。被孢霉属在各处理中相对丰度为9.09% (MM)～13.76% (MR), 是本试验土壤中丰度最高的真菌属。进一步分析发现, MR土壤被孢霉属相对丰度显著高于MP及MM模式, 与其他处理无显著性差异。绿僵菌属在各处理中相对丰度为3.56% (MW)～16.40% (MSp), 在土壤中的平均相对丰度仅次于被孢霉属, 在MSp土壤中分布较为丰富。拟棘壳孢属在MM土壤中具有极显著优势, 相对丰度达19.56%, 在轮套作模式土壤中相对丰度仅为3.48% (MPo)～8.90% (MW), 相对丰度表现为: MM＞MW＞MP＞MR＞MSp＞MPo。

图3 不同春玉米多熟种植模式的土壤主要真菌属差异分析Fig. 3 Difference analysis of soil major fungi of multiple cropping systems based on spring maize on genus level

2.4 不同种植模式的土壤真菌群落功能预测

通过FUNGuild功能预测(图4), 发现不同种植模式土壤中, 除了腐生营养型(sprotroph)、病理营养型(pathotroph)及共生营养型(symbiotroph) 3大基本营养型外, 还包括多种过渡营养型。MM土壤真菌主要以病理-腐生-共生过渡(pathotroph-sprotrophsymbiotroph)、腐生营养型及病理营养型为主, 相对丰度分别为26.39%、26.09%及22.48%, 且MM中病理-腐生-共生过渡营养型相对丰度显著高于其他多熟种植模式。MW主要以腐生营养型真菌为主, 相对丰度为29.99%, 其他已知营养型相对丰度均在20%以下。其他多熟种植模式中腐生营养型(相对丰度21.11%～27.88%)及病理营养型(相对丰度23.74%～30.41%)均占有较大比例。另外, 各模式土壤中腐生营养型真菌没有表现出显著性差异, 说明种植模式对于土壤中相对丰度较大的腐生型真菌影响不显著。在多熟种植模式中, 与Msp和MP相比, MW显著降低了土壤病理营养型真菌相对丰度。

图4 基于FUNGuild预测的不同春玉米多熟种植模式的土壤真菌功能差异Fig. 4 Difference in soil fungal function of multiple cropping systems based on spring maize predicted by FUNGuild

2.5 土壤真菌群落结构与环境因子的关系

土壤理化性质结果表明, 不同种植模式对土壤养分、容重、田间持水量等土壤理化性质均有显著影响, 但对水稳性团聚体平均重量直径(MWD)无显著影响(表3)。土壤真菌群落与环境因子冗余分析结果表明(图5), 在属水平上, 环境因子对土壤真菌群落变化的解释度为53.23%, 其中第1排序轴(RDA1)解释度为47.33%, 第2排序轴(RDA2)的解释度5.90%, 表明环境因子能够在一定程度上解释土壤真菌群落的差异。从结果来看土壤有机质 (=0.57,＜0.05)及土壤容重 (=0.56,＜0.05)对真菌群落分布影响显著。进一步对具体真菌群落进行分析(图6),结果表明在丰度前30的真菌属中, 有13个真菌属与环境因子表现出显著的相关关系。其中, 土壤真菌群落组成受到一个或多个土壤理化指标的影响, 其中大部分土壤真菌属受到多个理化指标的影响。除了有机质含量及土壤容重以外, 多个真菌属还受到土壤田间持水量的调控。同一理化因子既有正相关真菌群落也有负相关真菌群落, 说明土壤真菌群落整体趋于稳定平衡。

图6 基于Spearman相关性分析的土壤丰度前30的真菌属与环境因子相关性热图Fig. 6 Correlation heatmap based on Spearman analysis of top 30 soil fungal genera and environmental factors

表3 不同春玉米多熟种植模式的耕层土壤理化性质(0～20 cm)Table 3 Physical and chemical properties of plough layer soil (0-20 cm) multiple cropping systems based on spring maize

图5 不同春玉米多熟种植模式的土壤真菌群落与环境因子冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis (RDA) of soil fungal community and environmental factors of multiple cropping systems based on spring maize

3 讨论

3.1 不同种植模式对土壤真菌群落组成的影响

试验表明相比于春玉米单作, 轮、套作种植模式能够提高土壤真菌多样性而对丰富度没有显著影响, 这与刘蕾等、丁俊男等的研究结果基本一致, 植物多样性与土壤真菌的多样性联系紧密, 轮、套作种植模式能够提高土壤真菌多样性的原因可能与作物的多样性有关, 春玉米单作模式, 作物单一且多年连作, 导致土壤真菌群落组成相对单一。作物的根际分泌的糖类、有机酸类及氨基酸类有机物质是土壤微生物的重要营养来源之一, 不同作物的根际分泌情况有所差异。轮、套作种植模式中, 可能由于其他作物的添加, 改变土壤微生物对单一碳源的利用能力, 进而改善土壤微生态环境。

在群落组成方面, 各模式优势真菌门相同, 且子囊菌门在真菌群落分布中占有绝对优势, 这与李晋等对于旱作农业区土壤真菌群落多样性研究一致。其中, 被孢霉门在MR处理中相对丰度最高, 且显著高于MM模式。而研究表明, 被孢霉属是被孢霉门中主要的真菌属, 是常见的陆生好气真菌, 对土壤水分和通气状况表现出较高的敏感性, 有溶解土壤中的磷, 分解纤维素及半纤维素等增加土壤有机质和养分含量的功能。在各处理中, 轮、套作处理土壤被孢霉属相对丰度均高于MM, 且MR表现出显著优势, 可能是黑麦的加入, 丰富了土壤根系组成, 增加了土壤孔隙度, 进一步增加土壤的通气状况。结合Detheridge等研究表明黑麦草等牧草种植后的真菌群落对后续作物种植有遗留影响, 且亦对被孢霉属等有益菌影响显著, 加之黑麦草根系发达, 根际分泌物丰富, MR模式富集被孢霉门真菌可能受到前茬黑麦草种植效应的影响。进一步对各模式真菌属水平群落组成进行分析, 结果表明菠菜-春玉米模式对绿僵菌属这种具有生防功能的有益菌影响较大, 但具体原因还有待探究。MM处理中潜致病菌拟棘壳孢属含量远高于其他模式, 这可能是由于种植结构单一, 长期连坐, 导致病原菌在土壤中富集的同时抑制了有益菌的生长。土壤真菌群落组成受到多种因素的共同作用, 包括植被组成结构、肥料和外源添加物、土壤类型、耕作方式等因素, 因为不同模式的管理方式按照常规管理方式进行管理, 除作物不同以外, 施肥量及管理方式等因素按照作物需求有所不同, 所以整体因素复杂, 有待进一步研究。

3.2 不同种植模式的土壤真菌群落功能预测

为适应环境变化, 真菌群落在不同阶段可同时采用多种营养方式。本试验中, 腐生型真菌和病理型真菌是土壤中真菌的主要营养型, 这与彭小武等的研究结果一致。腐生营养型菌群的主要作用是进一步将土壤中的有机质分解为植物能够吸收的矿物质营养, 子囊菌门多为腐生菌, 是土壤重要的分解者。本试验腐生营养型菌群占比较高, 可能因为土壤子囊菌门相对丰富较高, 这可能与玉米季丰富的秸秆残茬还田为相关微生物群落提供了营养有关。病理营养型菌群通过从寄主获取营养, 可能对植物产生不良影响。虽然其他模式病理营养型菌群与春玉米单作模式无显著性差异, 但是春玉米单作模式中显著提升了病理-腐生-共生型真菌, 可能会增加作物感病风险。另外, 本试验中未知/未定义功能菌平均占比21.35%, 说明对土壤真菌营养型的注释还不够完善, 土壤真菌功能仍然有待挖掘。

3.3 土壤真菌群落结构与环境因子的关系

土壤真菌群落组成及多样性受多种环境因子的影响, 且影响不同真菌群落的主要环境因子也不同。Wardle等对全球土壤多样性研究中指出土壤真菌群落组成受土壤特性, 特别是土壤pH和钙含量的积极影响。何苑皞等对杉木[(Lamb.) Hook.]人工林土壤真菌多样性的研究中发现, 土壤的含水量、有机质、速效磷、速效钾是影响土壤中真菌分布的主要环境因子; 代红翠等对不同耕作方式和秸秆还田下褐土真菌群落多样性的研究中, 发现土壤有机碳是影响真菌群落的主要环境因子。这些研究说明土壤真菌群落受多方因素的影响, 在不同环境条件下影响真菌群落的主要影响因子不同。本试验结果表明田间持水量、土壤有机质含量及土壤容重与多种真菌属相关性紧密, 是本试验中调控真菌群落结构的主要环境因子。土壤真菌群落受土壤有机质影响较大, 此结果与方韬等研究结果一致, 这可能与各模式作物凋落物及残茬还田有关, 作物凋落物及残茬在土壤中分解也为土壤真菌提供了营养物质。土壤水分和通气状况对土壤真菌群落分布也有显著影响, 土壤容重和田间持水量可能通过影响土壤水分和通气状况影响真菌群落结构。

4 结论

通过对华北平原以春玉米为主的不同种植模式土壤真菌群落多样性分析, 发现土壤容重、田间持水量与土壤有机质是本试验中影响土壤真菌群落结构的主要环境因子。与春玉米单作相比, 春玉米轮、套作其他作物不会显著降低玉米的产量且能够显著提高土壤真菌群落的多样性, 其中春玉米-黑麦、菠菜-春玉米及冬小麦-夏玉米轮作模式在提高土壤真菌多样性, 富集有益微生物群落方面均有良好表现。此外, 黑麦或菠菜轮作春玉米模式在一定程度上能降低潜在致病菌丰度。因此, 从土壤微生物角度, 如果华北平原把传统的冬小麦-夏玉米模式两熟制变为春玉米一熟制, 有降低土壤质量的风险。发展春玉米需要与其他合适作物构成节水保地的多熟种植模式。从本研究来看, 春玉米与黑麦或菠菜轮作的模式或是更合适的模式。