龈沟液中miR-146a、miR-21表达水平与种植体周围炎的相关性研究

钟秋 陈艳莉 冷建琼 周吉

种植体周围炎是因口腔细菌微生物导致的组织炎症，是致炎因子引起的破骨细胞活化导致的牙槽骨吸收平衡遭到破坏，可导致种植体松动脱落，进而影响种植效果[1，2]。因此，及早发现种植体周围炎具有重要意义。miR-146a是炎症因子信号传导的重要物质，而miR-21可通过多种途径参与调控细胞分化和更新，参与牙周组织修复，且二者均参与牙周炎等慢性炎症疾病发展过程，但有关其在种植体周围炎中的作用机制报道较少[3，4]。本研究以我院108例行种植体修复患者为研究对象，检测其龈沟液中miR-146a、miR-21水平，分析其表达水平与种植体周围炎的关系，旨在为临床种植体周围炎预防及治疗提供参考，以提高牙种植修复效果。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取我院2019年7月～2020年7月收治的进行牙种植修复的108例患者（共108枚）为研究对象，年龄25～78岁，平均（48.56±2.43）岁；其中男62例，女46例。根据种植体检测指标情况将患者分为健康种植体组48例（48枚）、种植体周围炎组60例（60枚）。其中健康种植体组中男30例，女18例，年龄23～76岁，平均（47.83±2.35）岁；种植体周围炎组中男32例，女28例，年龄23～78岁，平均（48.72±2.76）岁。选取同期体检牙龈健康的75例健康者作为对照组，年龄23～77岁，平均（47.32±2.51）岁；其中男40例，女35例。三组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准：①口腔情况良好，首次进行种植牙修复术；②种植6个月后进行相关检查获取牙龈完整数据，X线片显示种植体骨组织破坏程度，轻度骨吸收，即出现骨丧失则为种植体周围炎；③参照美国牙周病协会制定的牙周病新分类方法《种植义齿》[5]中相关标准确诊为种植体周围炎；健康种植体诊断标准为：探诊无出血、化脓、疼痛等情况，且无软组织增生；④患者知情且签署知情同意书。排除标准：①合并全身系统性疾病；②进入本研究前3个月服用过抗生素类药物；③合并慢性咽炎、扁桃体炎等口腔局部炎症疾病；④妊娠期及哺乳期妇女。本研究获我院伦理研究委员会批准（批号：2022-033-01）。

1.2 样本采集 以清水漱口后使用无菌干棉球擦干牙面，隔湿取样，用探针去除菌斑，然后将滤纸条插入牙龈保持60s，取出滤纸，测量浸润长度，并将浸润部分装入抗凝管内，震荡1h，以4℃ 1000r/min离心10min，取上清液置于-70℃冰箱保存待测。

1.3 临床指标测量 用牙签探诊检查所有种植体的近侧、近中、远中颊侧、舌侧4个位点的探诊深度数据结果，取其平均值作为最终结果。使用专用的牙周探针所测得的龈袋或牙周袋深度，是龈缘至袋底或龈沟底的距离，即为探诊深度。根据龈沟出血指数评分标准对所有种植体龈沟出血情况进行评估：0分表示牙龈健康不出血；1分表示牙龈轻度炎症；2分表示牙龈轻度炎症且探诊后点状出血；3分表示牙龈中度炎症，探诊后血滞于龈沟内；4分表示牙龈重度炎症，探诊后血溢出龈沟；5分表示探诊后牙龈出血。计算龈沟液量。采用CT检测患者牙槽嵴高度，即种植体根尖部到种植体颈部标志点间垂直距离，若骨高度变低，则该部分为骨吸收量。

1.4 龈沟液中miR-146a与miR-21水平检测 取龈沟液待测样品于室温解冻后，采用实时荧光定量复扩增法（qRT-PCR）检测龈沟液中miR-146a、miR-21水平。使用miRNA提取试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）提取总miRNA，然后使用反转录酶试剂盒（上海化科实验器材有限公司）将miRNA反转录成cDNA，miScript SYBR GreenPCR Kit（上海力敏实业有限公司）进行PCR，反应条件：95℃ 15s，95℃50s，60℃ 15s，共40个循环。以内源性U6小核RNA进行标准化，正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。通过2-ΔΔCT方法计算miR-146a、miR-21相对表达水平。

1.5 临床指标比较 检查并测量所有种植体的探诊深度、龈沟出血指数、龈沟液量、骨吸收量，然后进行组间分析比较。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件统计数据，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，多组比较采用F检验；相关性分析采用Pearson直线分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床指标比较 种植体周围炎组龈沟出血指数、探诊深度、龈沟液量、骨吸收量均显著高于健康种植体组（t=17.848、8.641、18.918、15.785，P＜0.05）和对照组（t=21.321、11.501、23.535、30.188，P＜0.05），健康种植体组亦高于对照组（t=3.872、2.178、3.858、9.934，P＜0.05），且组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 龈沟液中miR-146a与miR-21水平比较 种植体周围炎组龈沟液中miR-146a、miR-21水平均显著高于健康种植体组（t=9.768、7.952，P＜0.05）和对照组（t=20.310、20.657，P＜0.05），健康种植体组亦高于对照组（t=15.646、19.662，P＜0.05），且组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 3组临床指标比较（±s）

表1 3组临床指标比较（±s）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与健康种植体组比较，②P＜0.05

组别 龈沟出血指数 探诊深度（mm） 龈沟液量（μl） 骨吸收量（mm）种植体周围炎组（n=60） 3.24±1.03①② 4.23±1.15①② 1.95±0.36①② 2.71±0.45①②健康种植体组（n=48） 0.79±0.24① 2.72±0.64① 0.87±0.23① 1.48±0.36①对照组（n=75） 0.65±0.18 2.51±0.48 0.72±0.22 1.03±0.14 F 366.916 82.854 342.386 351.916 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 龈沟液中miR-146a与miR-21水平比较（±s）

表2 龈沟液中miR-146a与miR-21水平比较（±s）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与健康种植体组比较，②P＜0.05

组别 miR-146a miR-21种植体周围炎组（n=60） 3.86±1.15①② 3.65±1.12①②健康种植体组（n=48） 2.21±0.56① 2.34±0.58①对照组（n=75） 1.01±0.32 0.89±0.24 F 242.797 247.640 P 0.000 0.000

2.3 龈沟液中miR-146a、miR-21水平与临床指标的关系 龈沟液中miR-146a与miR-21水平与龈沟出血指数、探诊深度、骨吸收量呈正相关（P＜0.05），与龈沟液量无关（P＞0.05），见表3。

表3 龈沟液中miR-146a、miR-21水平与临床指标的关系

3 讨论

由于种植体周围组织代谢与免疫能力降低，当口腔卫生不佳时易出现种植体周围炎。据相关研究表明，种植体周围炎发生率高达20%左右，其可导致种植体脱落、种植术失败，因此明确种植体龈沟液中相关指标与种植体周围炎临床指标的关系，对于预防种植体周围炎发生及牙种植成功具有积极意义[6]。本研究显示，种植体周围炎组患者龈沟液中miR-146a与miR-21水平呈高表达，其表达水平与种植体周围炎临床指标呈正相关，对于评估种植体周围炎的发生具有较好价值。

本研究结果显示，种植体周围炎组龈沟出血指数、探诊深度、龈沟液量、骨吸收量均显著高于健康种植体组和对照组，说明龈沟出血指数、探诊深度、龈沟液量可反映种植体周围炎活动状况及炎症程度，是种植体周围炎炎症进展及牙周组织损伤程度的重要评估指标[7，8]。骨吸收量是骨重建的重要参考指标，骨吸收增加会使牙体稳定性下降。探诊深度表示牙周袋深度，在炎症牙龈中深度更深，是评估牙周健康状况的重要临床指标之一，组织有炎症时牙龈探针可穿透结合上皮进入结缔组织内，而健康牙龈则中止于结合上皮，因此在炎症牙龈中深度更深。龈沟液量水平可反映牙周组织炎症情况。龈沟出血指数是评估牙龈炎症活动期状况的临床指标，是评估牙周炎症的重要指标之一[9，10]。

通过检测龈沟液中miR-146a与miR-21水平发现，种植体周围炎组龈沟液中miR-146a、miR-21水平均显著高于健康种植体组和对照组，说明miR-146a与miR-21可能与种植体炎症反应有关。对龈沟液中miR-146a、miR-21水平与种植体牙周炎症临床指标进行Pearson相关性分析发现，miR-146a及miR-21水平与龈沟出血指数、探诊深度、骨吸收量呈正相关，可作为评估种植体周围组织健康状态的重要指标之一。究其原因为微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码的小分子RNA，参与细胞多种生物学过程，在慢性炎症疾病中表达异 常[11，12]。miR-146包 括miR-146a和miR-146b两个亚型，miR-146a是重要的免疫调控因子，在慢性炎性疾病中呈高表达，可能与介导炎症因子信号传导，发挥免疫细胞分化及免疫调节功能，参与慢性炎症反应过程有关[13，14]。动物实验表明，miR-146a在牙龈炎性组织中呈较高表达，其可促进巨噬细胞活性增强，介导炎症因子释放增加，进而参与炎症反应调节过程，可能是导致牙周炎症发展的重要原因[15，16]。miR-21是参与细胞增殖、分化的重要的miRNA，miR-21可通过调控RunX2蛋白，发挥对成骨细胞的调节作用，可反映成骨细胞转化趋势。牙周干细胞具有更新、分化和免疫调节特性，在维持牙周环境稳定中发挥重要作用。牙周有炎症时炎性因子大量分泌，促进破骨细胞活化，导致骨吸收失衡，进而影响种植体稳定性[17，18]。较高水平的miR-21可刺激超氧化物歧化酶分泌，促进巨噬细胞分泌，活性增加，与超氧化物歧化酶水平呈正相关[19，20]。也有研究指出，miR-21可通过促进间充质干细胞增殖，促进成骨分化，进而参与牙周组织损失、修复过程，其水平升高与牙周组织损伤程度密切相关[21]。通过检测龈沟液中miR-146a与miR-21水平可了解牙周组织炎症活动状况及牙周组织损伤情况，进而为种植体周围炎评估提供参考。对种植体周围炎症组织进行有效清除，以骨替代材料填充引导骨组织再生，促进新骨形成，进而提高种植成功率[22]。但吸烟、饮酒、不良口腔卫生习惯等会影响种植体组织修复情况，因此，miR-146a与miR-21在种植体周围炎中的作用机制还需进一步研究，进而为临床种植成功率的提高提供参考。

综上所述，种植体周围炎患者龈沟液中miR-146a、miR-21水平显著升高，其可为预测种植体周围炎发生提供依据，通过预防种植体周围炎发生，以提高牙种植效果。