流式细胞术分选小鼠骨髓造血干细胞的技术方案

户乃丽

（首都医科大学中心实验室，北京 100069）

造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是生成各种血细胞的最起始细胞，又称多能造血干细胞，有着长期自我更新能力和分化成各类成熟血细胞的潜能［1］。常用的流式检测手段主要有两类，依据细胞功能和表面标记物，前者主要是依据干细胞表面的ATP结合转运蛋白，能够将进入胞内的核酸染料Hochest33342排出而识别出HSCs［2］，后者目前应用更为广泛，采用多个表面标记共同标记造血干细胞，应用较广泛的如LSK（Lineage-，Sca-1+，c-Kit+）方案［3，4］，在该群体中，还存在一些祖细胞，因此SLAM（Signaling lymphocyte activation molecule）家族蛋白CD48、CD150被加入识别长期造血干细胞（long-term HCSs，LT-HSCs，CD48-CD150+LSK）、短期造血干细胞（short-term HCSs，ST-HSCs，CD48+CD150+LSK）和多能造血祖细胞（multipotential hematopoietic progenitor cell，MPPs，CD48+CD150-LSK），其表达不受小鼠品系和发育阶段等的影响［5］。流式技术可以根据表面标识物将HSCs各亚群识别并实现精确的分选，但是在实际操作中遇到的困难是：首先HSCs含量过低，分选后所得到的细胞纯度欠佳，其次分选时间过长，细胞活性难以保证，因此，本实验结合Lineage磁珠对样品进行预纯化，并加入识别细胞死活的染料7-AAD，建立了一种高效的检测和高纯度分选小鼠骨髓造血干细胞方案。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6小鼠20只，SPF级，体质量28～30 g，5～6周龄，购于首都医科大学实验动物部，饲养温度20～25℃，湿度40%～70%，正常饮水进食。

1.2 试剂与仪器

Lineage Cell Depletion Kit试 剂盒，MiniMACS分离器及分离柱购自Miltenyi Biotec；台盼蓝，7-AAD试 剂 购 自Sigma Aldrich；lineage cocktail-FITC、 c-Kit-APC、 Scal-1-Percp-cy5.5、CD48-BV421、CD150-PE购自Biolegend；荧光补偿微球购自eBioscience；红细胞裂解液、流式细胞仪质控CST微球、Accudrop beads购自BD；实验所用仪器为BDAriaⅢ型流式细胞分选仪，配有488 nm、561 nm、633 nm、405 nm 4只激光器。

1.3 实验方法

1.3.1 骨髓单细胞悬液的制备

颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下去除胫骨及股骨，去除周围肌肉，剪开骨骺端，用5 ml的注射器吸取PBS+2%胎牛血清反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液并用注射器反复吹打，200目过滤网过滤，制成单细胞悬液，而后加入5mL红细胞裂解液，混匀，室温孵育10分钟，离心机1500 r/min离心5分钟，弃上清后加入PBS离心漂洗1～2次重悬浮，得到骨髓单细胞悬液。平均每只小鼠可获得骨髓细胞5×107个细胞。

1.3.2 分选仪器的准备

仪器准备主要是液流参数和断点的调节，鞘液桶和水桶用75%酒精浸泡消毒4h以上，用纯水冲洗干净，鞘液桶中加入无菌PBS，运行开机程序，安装85 μm喷嘴，分选电压4500V，Freq设定为47.4，调节液滴振幅Ampl，使GaP值和Drop1维持稳定，而后选中主液流框的sweet spot键开启液流自动监控。上样Accudrop beads微球调节液滴延迟为30.31，微球在initial或fine tune模式下都达到侧液流偏转以99%以上，此时仪器具备分选条件。

1.3.3 流式细胞染色和分选

将收集到的骨髓细胞，Fc-R阻断剂封闭后根据说明书配比加入anti-mouse lineage cocktail-FITC、c-Kit-APC、Scal-1-Percp-cy5.5、CD48-BV421、CD150-PE，4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，将细胞悬液加PBS定容至2 ml，加入20 μl 7-AAD混匀待上机，上样后通过阴性对照和扣除对照管确定目的细胞群，收集各群细胞比例数据并圈定Lineage-，Sca-1+，c-Kit+细胞群体进行分选，接收管中预置0.5 mL培养基或工作液接收所得细胞。

1.3.4 磁珠纯化后流式分选

取5×107个骨髓细胞，加入50μL生物素抗体Biotinylated lineage cocktail，4℃孵 育30 min，PBS清洗1次，加入100μL抗生物素抗体磁珠，4℃孵育15 min，PBS清洗1次，将磁柱置于磁力架上，将单细胞悬液经过磁柱分选，收集流下的细胞再次过磁柱，PBS冲洗磁柱一次，收集磁珠分选后的液体，离心去上清定容，依次加入按配比加入流式检测抗体，染色和流式分选LSK细胞方法同前。

1.3.5 分选后纯度检测

吸取400 μL分选后的细胞上流式细胞仪，在原分选方案中检测分选后细胞的纯度及各亚群的表达。

1.3.5 分选后细胞存活率检测

吸取新提取的细胞悬液90 μL，加入0.4%台盼兰溶液10 μL，充分混匀后。加入改良的牛鲍计数板，显微镜下观察细胞见未被染色细胞为活细胞。细胞存活率=拒染细胞数/细胞总数×100%。

1.4 统计学处理方法

采用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠骨髓干细胞的染色结果

每个样品收集1～2×106的细胞数据得到正常小鼠造血干细胞比例，7-AAD-活细胞为81.5±4.2%，Lineage-细胞（P2），LSK（P3）及LT-HSCs、ST-HSCs、MPPs各群细胞（Q1、Q2、Q3）比例如表1所示，图1显示为单次检测结果，P3门为分选的目的细胞群。

图1 正常小鼠骨髓干细胞检测结果

表1 正常小鼠骨髓干细胞分群表达情况（x±s，n=4，% Parent：在上一级逻辑门中的比例）

2.2 流式直接分选和磁珠加流式分选结果

骨髓细胞经Lineage-磁珠预纯化后，Lineage-细胞 群 由 原 来 的（13.1±2.35）%增 加 为（53.6±4.35）%，如图2所示（P＜0.05），由于Lineage-细胞的富集，使得LSK由之前的（0.2±0.03）%Total增加至（5.6±0.2）%Total，此富集后的样品再经流式染色分选，LSK可近一步纯化为（93.6±1.1）%，比单一流式分选纯度（82.5±1.7）%有所提升，如图3（P＜0.05）。5只小鼠骨髓细胞混合共得到LSK+细胞约为3×105。CD150，CD48在LSK中各亚群比例不受磁珠和流式分选的影响，相比分选前无显著变化。

图2 磁珠分选前后Lineage-细胞比例的变化情况

图3 LSK细胞分选结果

2.3 分选后LSK细胞存活率

经台盼兰染色计数，流式分选细胞存活率（91.3±2.03）%，磁珠+流式分选得到细胞存活率为（90.7±1.54）%，P＞0.05。

3 讨论

3.1 样品的染色

小鼠造血干细胞最常用的表面标记分子是LSK，同时，可通过SLAM家族蛋白CD150，CD48进一步将细胞分为3个亚群，即LT-HSCs、ST-HSCs，MPPs。LT-HSCs具有很强的自我更新能力，可以维持机体终生的造血，但由它分化而来的ST-HSCs以及MPPs只能在短期内执行造血功能［6］，MPPs具有多向分化潜能，可进一步分化为淋巴祖细胞和骨髓祖细胞。无论是LSK，或者CD150，CD48，在全部骨髓细胞中都属于低表达量，因此在荧光抗体的选择上应注意选择荧光强度较强或中强的抗体，例如：PE、BV421、APC等，而Lineage+细胞属于被排除掉的部分，因此要选取荧光强度较弱的FITC等荧光素。若抗体荧光强弱搭配不当，有可能导致含量低的LSK细胞被掩盖［7］，阳性率不准确。由于实验样品在抽吸冲洗骨髓组织以及离心过程中不可避免地产生死细胞，因此检测方案中加入识别细胞死活的染料是必要的，对于检测，死活染料的加入可去除死细胞引起的非特异着色，对于分选，有助于提高分选后细胞的活性。目前流式多用的细胞死活染料分为两大类，核酸染料和氨基反应性染料［8］，氨基反应性染料可以用于标记固定和非固定过的细胞，染色后需要洗涤，有可能对细胞数量造成少量损失。核酸染料以7-AAD为主，主要适用于非固定细胞的表面标记物的染色，7-AAD的优点在于染色快捷，样品上机前加入，无需洗涤，缺点是它的激发和发射光谱范围较宽，与PE，APC等常用染料存在漏光，样品检测时需设立单阳样品调节补偿。对于本方案由于Sca-1、c-Kit、CD48、CD150表达量低，在调节补偿时，单阳样品的阳性峰非常不明显，无法准确调节补偿值，因此，对于这一类低阳性率样品，推荐使用荧光补偿微球进行各通路补偿值的调节。

3.2 样品的分选

分选后细胞数目，细胞的活性和纯度是评估分选效果的重要指标。AriaⅢ型流式细胞仪每小时识别处理约为1～2×107个细胞，对于含量仅有0.1～0.2%的LSK细胞群，直接分选的弊端在于耗费时间过长，获取目的细胞困难，分选后纯度不佳。在本实验中，由于样品中含有约90%的Lineage+细胞群的干扰，因此，利用生物素抗体Biotinylated lineage cocktail，再经生物素与磁珠结合，将样品过两遍分离柱，去除一半以上的Lineage+细胞，可显著提升目的细胞LSK在样品中的比例，明显缩短分选时间。由于在实际操作中，磁珠分选会造成细胞总数的损失，因此，在此方案中，不必要求将Lineage-细胞纯化至90%以上，只需去除一半即可，这样可避免细胞过多丢失且能节省抗体，再结合后续的流式分选，能够得到纯度90%以上的LSK细胞。

对于实验中使用的FACSAriaⅢ型流式细胞仪，在流式细胞仪分选设置上，首先要注意调节稳定的液流参数，液流的稳定是保证分选准确进行的基础，分选过程中开启液流“sweet spot”模式，一旦液流不稳定时分选能够自动停止，防止液滴飞溅污染影响收集管中细胞的阳性率。此外，液滴延迟的调节是十分重要，可自动结合手动重复调节确定正确的Drop delay数值，一旦液流参数发生变化，需要重新校准Drop delay，这些是保证分选进行的基本条件。在分选过程中，选取的是85 μm的喷嘴，上样速度控制在6000～8000 evts/秒，此时回收率可达85～90%之间，较少有细胞丢失，通过上述手段，可以将含量仅为0.1～0.2%Total的LSK纯化为91.3±2.03%，同时活性也在90%以上，能够满足后续实验研究。