云南地方猪FATP1基因多态性分析

张 斌，韩 敏，刘韶娜，相德才，熊和丽，张 彦，赵智勇

（云南省种猪性能测定站/云南省种猪质量检验测试中心/云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224）

作为脂肪酸转运蛋白家族（FATPs）的一员，脂肪酸转运蛋白1（FATP1）基因首次在小鼠脂肪细胞中被发现[1]，其主要功能可能是运输脂肪酸到相应组织合成甘油三酯[2-4]。目前，猪FATP1基因的cDNA序列已经公布[5]，且该基因定位于2号染色体的2q1.2-2.1位置[6]。研究表明，FATP1基因与脂肪性状的形成具有显著相关性[7-8]。因此，本研究将其作为影响猪脂肪沉积的候选基因，采用PCR扩增、直接测序、序列比对等技术，在猪FATP1基因第一内含子、第一外显子和第二内含子等区域寻找可能存在的多态性位点（SNPs），检测SNPs位点在云南地方猪杂交后代中的遗传分布，为云南地方猪的杂交选育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验耳组织样品从云南省畜牧兽医科学院试验场于2017年11月至2019年4月饲养的试验猪中采集。随机采集41头杜藏猪（杜洛克×迪庆藏猪）（♂20头、♀21头）、56头杜小猪（杜洛克×滇南小耳猪）（♂30头、♀26头）、52头杜小藏猪（杜洛克×滇南小耳猪×迪庆藏猪）（♂25头、♀27头）耳组织，共149份，置于装有75%酒精的离心管中，-70 ℃保存。

1.2 基因组DNA提取及检测

使用天根生化科技有限公司（北京）的组织DNA提取试剂盒提取试验猪耳组织样品中的DNA，共149份，置于-80 ℃保存。提取的基因组DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用TE缓冲液稀释备用。

1.3 引物设计

根据GenBank提供的猪FATP1全基因序列（NC_010444.4），采用Primer Premier 5.0软件设计1对引物扩增试验猪的FATP1基因，引物序列为：正向引物序列为（F1）5'-GATCACAATAGCA CTACCTGGC-3'，反向引物（R1）5'-GATCCAATCCC CATCTCACTCT-3'，扩增片段长度为776 bp，委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.4 PCR扩增及条件

PCR扩增体系：12.5 μL Mix，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），2 μL（约50 ng）DNA，ddH2O补至25 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.5 目的基因测序及多态性检测

试验猪的FATP1基因PCR扩增后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果，而后送到北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行正向测序，然后利用DNAStar（5.0）软件的SeqMan程序检测多态性位点。

1.6 统计分析

采用Excel软件统计目的基因多态性位点的基因型，并计算各多态性位点的基因型频率、等位基因频率、杂合度（He）和多态信息含量（PIC）。

2 结果与分析

2.1 猪FATP1基因PCR扩增结果

以试验猪耳组织基因组DNA为模板，用F1/R1引物扩增猪FATP1基因的第一内含子、第一外显子和第二内含子等区域，扩增获取的目的片段（图1）与预期大小一致，无非特异片段出现，可用于进一步的DNA测序。

2.2 猪FATP1基因目的片段序列分析结果

对149份试验猪FATP1基因的PCR产物进行测序及序列比对，发现与GenBank已公布的猪FATP1基因相同区域的序列吻合，确定目的片段为猪的FATP1基因序列。利用SeqMan程序分析发现，位于FATP1基因第一外显子上存在1个多态性位点（SNP）c.70 C＞T，且仅存在两种基因型，具体见图2。

2.3 猪FATP1基因的SNP位点的遗传分布情况

由表1可知，FATP1基因c.70 C＞T位点在杜藏猪群体中不存在变异，在杜小猪和杜小藏猪中存在变异，且均处于Hardy-Weinderg平衡（P＞0.05）。在杜小猪群体和杜小藏猪群体中的优势等位基因型均为CC型（基因型频率分别为0.82和0.75），优势等位基因均为C（等位基因频率分别为0.911和0.875）。进一步计算c.70 C＞T位点在各群体中的杂合度（He）和多态性信息含量（PIC），发现该位点在杜小猪群体和杜小藏猪群体中均属低度多态（He＜0.25，PIC＜0.25），说明该位点在杜小猪群体和杜小藏猪群体中受自然选择和人工选择的影响较大。

表1 猪FATP1基因SNP位点在试验群体中的遗传分布情况

3 讨论

目前，在金华猪、皮特猪、金皮F2代和杜洛克猪的FATP1基因上共检测到5个SNPs位点，分别位于5'调控区[9]的g-586 T→C和g-601 A→G及CDS区[10]的c.441C＞T、c.747A＞G 和 c.400C＞T。本研究设计1对引物扩增了猪FATP1基因的第一内含子、第一外显子和第二内含子等区域，在第一外显子检测出了1个SNP（c.70 C＞T）位点，并分析了该位点的遗传分布情况，发现在杜藏猪群体中仅表现为CC型，在杜小猪群体和杜小藏猪群体中表现为CC型和CT型，表明该位点可能在迪庆藏猪群体和杜洛克猪群体中不存在多态性，仅在滇南小耳猪群体中存在多态性，该结果与Melo等[10]在杜洛克群体中研究的结果基本一致。

研究表明，FATP1基因多态性位点的突变与猪的脂肪沉积具有显著相关性[9-10]，可能是该基因多态性位点的变异能够影响细胞外脂肪酸进入细胞内[11]，从而影响甘油三酯的生物合成[12]。然而有关c.70 C＞T位点与猪的脂肪沉积的相关性，还有待后续进一步研究。