天麻素经TLR4-NF-κB信号通路对帕金森大鼠的干预作用

李阳 邵宇

帕金森是临床常见的神经内科疾病，作为一种神经退行性病变，患者大多具有运动迟缓、四肢震颤、步态障碍等表现，严重影响身体健康、生活质量[1,2]。老年人为帕金森主要发病群体，据不完全统计，近年来我国每年新增帕金森病例数居高不下，引起广泛关注[3,4]。帕金森症状的发生发展受多种因素的共同作用，其具体发病机制尚未研究透彻[5]。目前西医药物治疗为常用的治疗帕金森的手段，但临床疗效并不十分理想，且会出现一些不良反应，并无一种特效的治疗帕金森的药物，因此中医药治疗帕金森逐渐成为神经科医生的重点研究方向[6,7]。本研究使用建立帕金森大鼠模式，并使用天麻素进行干预，观察效果。

1 材料与方法

1.1 材料 选取50只SD健康雄性大鼠[湖南师范大学医学院，许可证号：SYXK(湘)2019-0008]，年龄7～9周，平均(8.1±0.8)周；体重213～237 g，平均(225.1±9.6)g。所有大鼠于(22.9±2.7)℃环境中喂养。主要试剂：小鼠抗兔TLR4抗体(BD公司)；小鼠抗大鼠NF-κB p65抗体(Dako公司)；兔抗大鼠p38MAPK抗体(Gibco公司)；大鼠抗小鼠TNF-α(Sigma公司)；大鼠抗小鼠IL-1β、IL-6抗体(Hyclone公司)；兔抗大鼠Wnt3a抗体(Selleck公司)；小鼠抗兔β-catenin抗体(Invitrogen公司)。本研究获取医院伦理委员会批准。

1.2 建模及分组干预 随机挑选10只为正常组，其余40只建立帕金森模型。建模方法：葵花油乳油溶解鱼藤酮，浓度2 mg/ml，于大鼠颈背部皮下注射，1次/d，2 mg·kg-1·d-1，连续注射4周。大鼠出现肢体震颤、僵直、行动迟缓、步态不稳等现象即判定为建模成功。将建模失败及建模过程中死亡大鼠剔除，最终建模成功35只。将35只帕金森大鼠随机分为模型组8只及低、中、高剂量组各9只，正常组、模型组大鼠使用0.9%氯化钠溶液进行灌胃处理，低、中、高剂量组大鼠分别使用0.2、0.4、0.6 g/kg天麻素注射液进行腹腔注射，1次/d。所有大鼠连续干预14 d。

1.3 检测指标

1.3.1 学习、记忆能力检测:学习能力检测：将大鼠放入准备好的Y型迷宫内，5 min后进行电刺激，60 V电压持续6 s，大鼠感受到电刺激后直接逃至无电刺激区域为正确反应，大鼠在无电刺激区域停留30 s后再次放入电刺激中，按此步骤反复训练，连续训练10次，其中9次符合正确反应标准为训练合格，对比5组大鼠学习合格所用训练次数。记忆能力检测：Y型迷宫训练结束后，次日再次进行Y型迷宫训练，记录5组大鼠10次训练正确反应次数。

1.3.2 标本采集、HE染色:取5组大鼠腹部静脉血3 ml,离心处理(离心半径10 cm，转速2 500 r/min，离心时间15 min)，-50℃保存。对大鼠进行麻醉处理后颈椎脱臼法处死，取海马区脑组织，固定、完全浸泡在4%甲醛中，1 d后石蜡包埋、连续切片。切片脱蜡、脱水处理，苏木素染色，之后进行分化、冲洗、乙醇梯度脱水处理，伊红染色后再次进行乙醇梯度脱水，之后进行封片处理，显微镜下观察，并记录5组大鼠神经元数量。

1.3.3 Western blot法检测TLR4/NF-κB通路、Wnt/β-catenin通路蛋白表达:取各组大鼠脑组织切片，添加裂解液提取蛋白50 μg，蛋白定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜处理，室内环境封闭，3 h后1∶1 000添加一抗，4℃过夜孵育，次日取出后TBST清洗3次，之后1∶5 000添加二抗，室温孵育2 h后TBST清洗3次，显色、曝光、成像，检测TLR4/NF-κB通路、Wnt/β-catenin通路蛋白表达。

1.3.4 酶联免疫吸附实验检测炎性因子水平:标记酶标板，设置对照1、对照2、检测孔3孔，终止液、显色剂加入对照1孔，稀释标准品加入对照2孔，血清标本、抗体加入检测孔，封膜后震荡均匀，使用37℃保温箱培养1 h，之后去膜清洗，将水分吸干后添加显色剂晃匀，显色后添加终止液，450 nm处测吸光值，计算TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 结果

2.1 5组大鼠脑组织病理学观察 正常组大鼠脑组织神经细胞形态正常，结构完好，分布紧密，无病理变化。模型组大鼠脑组织细胞形态各异，细胞核破裂，排列杂乱，出现明显炎性细胞浸润情况；低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠细胞形态改善，排列较为规则，炎性细胞浸润情况缓解，其中高剂量组大鼠神经细胞形态基本正常，排列规则。见图1。

图1 5组大鼠脑组织病理学观察(HE×200)

2.2 5组大鼠学习、记忆能力比较 与正常组比较，其他4组大鼠达标所需训练次数较高、记忆成绩较低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠达标所需训练次数较低、记忆成绩较高(P<0.05)；与低、中剂量组比较，高剂量组大鼠达标所需训练次数较低、记忆成绩较高(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠学习、记忆能力比较

2.3 5组大鼠两侧神经元数量比较 与正常组比较，其他4组大鼠两侧神经元数量较低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠两侧神经元数量较高(P<0.05)，且高剂量组大鼠两侧神经元数量高于低、中剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠两侧神经元数量比较 个

2.4 5组大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白表达比较 与正常组比较，其他4组大鼠TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表达低于模型组，且高剂量组大鼠TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表达低于低、中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 5组大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白表达比较

2.5 5组大鼠炎性因子水平比较 与正常组比较，其他4组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平较低，且高剂量组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于低、中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 5组大鼠炎性因子水平比较

2.6 5组大鼠Wnt/β-catenin通路蛋白表达比较 与正常组比较，其他4组大鼠Wnt3a、β-catenin表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠Wnt3a、β-catenin表达较低，且高剂量组大鼠Wnt3a、β-catenin表达低于低、中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 5组大鼠Wnt/β-catenin通路蛋白表达比较

3 讨论

帕金森发病机制复杂性较高，有学者认为，环境、年龄、氧化应激、压力、家族遗传等均为危险因素[8]。临床治疗帕金森首选抗精神疾病药物，但是尚无一种特效药物能够彻底治愈，并且有些药物治疗安全性欠佳，会诱发一些不良反应，甚至具有肝肾毒性，因此越来越多的专家学者通过基础实验研究中医药对帕金森的干预效果[9,10]。天麻素主要提取自天麻根块部位，具有抑制血小板聚集、清除自由基、调节免疫等药理作用[11,12]，有研究表明，天麻素具有神经保护作用，但是关于天麻素治疗帕金森的效果及机制的研究还相对较少[13]。

大量临床研究表明，帕金森的发生发展伴随着机体神经功能、认知功能大幅减退[13,14]。有学者通过动物实验研究帕金森大鼠学习记忆能力变化，认为帕金森大鼠学习记忆能力较差，干预之后能够改善大鼠学习记忆能力，从而起到神经功能保护作用[15]。本研究设计Y型迷宫实验，实验发现，帕金森大鼠训练达标所需次数较多、记忆成绩较低，使用天麻素进行干预的大鼠达标所需次数下降，记忆成绩提升，并且随着天麻素剂量提升，效果更加明显，说明帕金森大鼠神经功能出现损伤，学习记忆能力大幅下降，使用天麻素进行干预，帕金森大鼠学习记忆能力明显提升，说明天麻素具有一定的神经保护作用，能够减轻帕金森大鼠神经、认知功能损伤，并且其能力具有一定的剂量依赖性。本研究还对帕金森大鼠脑组织神经元数量进行检测，发现帕金森大鼠神经元数量较低，使用天麻素干预的大鼠神经元数量上升，并且随着天麻素剂量提升，神经元数量上升幅度更加明显，进一步说明天麻素能够发挥神经保护作用。

有研究表明，帕金森症状的发生发展与炎性反应具有密切联系[16]。有研究表明，减轻脑组织炎性反应能够使机体神经损伤严重程度减轻，起到神经保护作用，从而对帕金森症状起到干预效果[17]。TLR4/NF-κB通路为广谱的炎症通路，包括TLR4、NF-κB p65、p38MAPK等蛋白，其表达变化在机体炎性反应发生发展过程中发挥重要作用[18,19]。TNF-α、IL-1β、IL-6均为TLR4/NF-κB通路下游炎性因子，三者水平变化与机体炎性反应发生发展密切相关。本研究发现，帕金森大鼠脑组织TLR4、NF-κB p65、p38MAPK相对表达量较高，使用天麻素进行干预后，TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表达下调，TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降，且天麻素剂量越高，TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平下调幅度越大，说明帕金森大鼠脑组织出现一定程度炎性反应，使用天麻素进行干预，能够调控TLR4/NF-κB通路蛋白表达，从而使下游炎性因子水平下降，减轻帕金森大鼠脑组织炎性反应，从而发挥神经保护作用。

有研究表明，帕金森患者认知障碍、神经功能损伤与机体脑组织神经元细胞凋亡具有密切联系，缓解脑组织神经元细胞凋亡是缓解帕金森病情的关键[20]。Wnt/β-catenin通路蛋白表达变化与细胞凋亡具有密切联系[21,22]。本研究显示，帕金森患者Wnt3a、β-catenin表达较高，使用天麻素干预的大鼠Wnt3a、β-catenin表达下调，随着天麻素应用剂量的提升，下调幅度更加明显，说明使用天麻素进行干预能够调控Wnt/β-catenin通路蛋白表达，从而抑制帕金森大鼠脑组织神经细胞凋亡，具有一定的脑保护作用。

综上所述，使用天麻素对帕金森大鼠进行干预，具有一定神经元损伤修复作用，其机制可能与减轻帕金森大鼠脑组织炎性反应、调控细胞凋亡蛋白表达有关，为帕金森的临床治疗提供一定的理论依据。