基于铁死亡相关的lncRNA在肺鳞癌预后的分析

江 山 戴 曦 杨小琼 蓝 楠

1 都江堰市人民医院呼吸与危重医学科(成都 611830)

2 西南医科大学呼吸与危重医学科(泸州 646000)

肺癌是全球最致命的恶性肿瘤之一，可分为两种主要类型：小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC占肺癌病例约85%，取决于发病和组织学形态，主要分为肺腺癌和肺鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of lung，LUSC)[1- 3]。当前许多治疗方法用于治疗肺癌，例如手术切除、化学疗法、放射疗法靶向疗法和免疫疗法。早期肺癌患者往往经历手术切除，对于晚期病人，其肿瘤不能被手术切除，靶向疗法或免疫疗法联合化疗已被选定作为最好的治疗方式之一[4- 5]。近年来，靶向疗法已经取得了长足的发展，并且已经确定了一些有效的分子靶标，例如表皮生长因子受体和间变性淋巴瘤激酶。已经证实这些靶点在肺腺癌中是成功的，但不是在肺鳞状细胞癌，因为这两个主要的亚型有不同的突变谱[6- 8]。

因此，为了更好地诊断和治疗LUSC患者，需要对新型生物标志物进行研究。LUSC占NSCLC病例的30%，在中老年男性中更为常见，并且转移和复发率很高[9]。NSCLC患者在晚期大多诊断，其5年生存率比早期患者低[4，10- 11]。因此，需要进一步研究预后标志物达到精确治疗的目的。虽然一些研究已经报道了LUSC相关基因和预后标记，在发病机理和LUSC的进展的特定分子机制还没有被系统地评价，这限制了早期诊断和治疗[12- 13]。对参与肺癌发生和发展的分子机制的深入了解可能为早期发现和后续临床治疗提供更有效的策略。因此，迫切需要新颖的有前途的生物标志物或潜在的药物治疗方法。

铁死亡是一种铁依赖性调节性细胞死亡的形式，由脂质过氧化的致死性积累所产生[14- 15]。近年来，铁死亡诱导已成为引发癌细胞死亡的一种有前途的治疗方法，特别是对于那些对传统疗法[16- 17]有抵抗力的恶性肿瘤。除了引起铁死亡的诱因外，许多基因也被鉴定为铁死亡的调节因子或标记物。

长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNAs)被发现在许多重要的生物学过程中发挥着广泛的功能，包括细胞增殖和分化、基因表达的遗传调控、RNA衰减、RNA剪接、蛋白质折叠和microRNA(miRNA)调节[18]。lncRNAs通过调节铁死亡参与肺癌的发生、侵袭和转移、预后和化疗耐药[19- 22]，但这些研究集中在单个lncRNAs治疗肺癌。TCGA数据库中lncRNAs的表达谱并没有用于探索预测肺鳞癌预后的新的生物标志物。因此，我们旨在利用TCGA数据库建立铁死亡相关lncRNA信号，并寻找新的生物标志物来预测肺鳞癌患者的预后。

1 资料与方法

1.1 数据集和样品提取

从癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获取了有关的RNA测序(RNA-seq)数据。纳入标准如下：(1)诊断为LUSC；(2)患者具有完整的lncRNA数据和临床信息。根据纳入标准，纳入502例LUSC。此外，患者的完整临床信息可从TCGA下载。在筛查临床信息时，排除了随访时间少于30天的样品。本研究涉及的数据全部来自TCGA数据库，并严格遵循TCGA发布指南(http://cancergenome.nih.gov/abouttcga/policies/publicationguidelines)。

1.2 lncRNA和铁死亡相关基因的筛选

从所有RNA-seq数据集里获取lncRNA的概况，总RNA表达数据则通过log2转化标准化。从以前的文献检索[23- 25]得到60 铁死亡相关基因，然后使用皮尔逊积矩相关系数计算lncRNA与铁死亡相关基因之间的相关，|R2|>0.3和P<0.001被认为是铁死亡相关的lncRNA。最后，使用Cytoscape软件3.7.2可视化其共表达网络。

1.3 鉴定铁死亡相关的lncRNAs

首先，通过单变量Cox回归评估铁死亡相关lncRNA的预后价值。在单变量分析中将P<0.05的铁死亡相关lncRNA纳入选择因子建立Lasso回归。然后将Lasso的结果包括在多元Cox模型中，以建立风险评分。我们构建了风险分数基于铁死亡相关lncRNA表达水平乘以回归系数的线性组合β：risk score=∑i=1nβi×(expression of lncRNAi)。根据中位风险评分，将患者分为2组：高风险组和低风险组。使用对数秩检验比较2组之间的生存差异。

1.4 预后模型的建立

利用Cox回归建立独立的预后模型，用列线图预测患者的生存率。应用index-C(C指数)，校准曲线和ROC曲线来验证模型的准确性。临床数据包括在多变量Cox回归中，以确认风险评分是否是预后的独立指标。

1.5 功能分析

基因集富集分析(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)用于探究基因表达数据的功能富集。我们探索了具有预后价值的铁死亡相关lncRNAs的功能富集，并可视化了与铁死亡相关的前5个基因本体论(Gene Ontology，GO)和基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路。

1.6 统计分析

使用Kaplan-Meier方法生成生存曲线，并使用对数秩检验进行比较。使用Cox回归和Lasso回归来估计铁死亡相关的lncRNA标志物和临床病理数据对预后的影响。使用R语言(版本3.6)进行统计分析。统计学检验为双侧检验，P≤0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 共表达网络的构建

TCGA-LUSC共鉴定出14 142个lncRNAs和19 631 个mRNA，其中59个基因在肺鳞癌中表达。构建铁死亡基因相关lncRNA共表达网络，最后有1 407个铁死亡相关的lncRNAs(|R2|>0.3，P<0.001)。

2.2 铁死亡相关lncRNA模型的构建

根据单变量Cox结果，15个铁死亡相关lncRNAs对肺鳞癌患者有预后价值(P<0.05)。随后，在Lasso回归分析后发现了14个铁死亡相关的lncRNAs(图1)。多元Cox回归分析发现4个lncRNAs是独立的预后因素(图2)。其中2个lncRNAs(LUCAT1、AC022150.2)为不良预后因素，2个lncRNA(AC253536.6和FLJ46906)为有利预后因素(表1和图3)。这4个lncRNA被用来建立铁死亡相关的lncRNA模型。风险评分的公式如下：风险评分=(-0.33598×AC253536.6)+(-0.05547×FLJ46906)+(0.17330×LUCAT1)+(0.22964×AC022150.2。

表1 基于TCGA-LUSC数据的lncRNAs多变量Cox结果

2.3 建立模型对预后的影响

风险评分与LUSC患者的总生存率(overall survival rate，OS)显著相关。与低风险组相比，高风险组的生存时间较短(P<0.001，图4)。Cox回归显示LUSC患者的风险评分对预后有显著影响(图5)。

2.4 铁死亡相关lncRNA信号的临床价值

单变量Cox回归分析显示，风险评分和分期是独立的预后指标，风险评分的HR为2.191(95%CI: 1.565～3.066，P<0.001，图6A)。在多因素临床特征中，风险评分仍然是多变量分析中的独立预后指标(HR=2.116，95%CI=2.116，P<0.001，表2，图6B)。ROC曲线下对应1年、3年、5年和7年生存率的面积分别为0.600、0.646、0636和0.726(图6C)。风险评分、年龄、TNM分期纳入列线图。如列线图所示，风险评分对LUSC患者7年的预后影响最大(图7A)。预后模型的C指数为0.763。5年生存率的AUC显示风险评分(0.726)具有一定的预测能力(图7B)。风险评分随分期增加，表明铁死亡相关的lncRNA信号可能与LUSC的进展有关。

表2 应用多元Cox回归分析LUSC的临床特征和危险度评分

2.5 功能分析

共获得126个GO相关通路和3 554个KEGG相关通路。在GO分析中，铁死亡相关的lncRNAs主要集中在生物过程中，如抗原结合、T细胞受体复合体、吞噬作用及基于免疫球蛋白家族结构域的适应性免疫应答(图8A)。此外，在KEGG途径显示lncRNAs主要集中在肿瘤经典途径和代谢途径，例如，ECM受体相互作用、白细胞跨膜转移、细胞凋亡和细胞内噬有关(图8B)。

3 讨 论

铁死亡是一种由有毒脂质过氧化集聚引起的非凋亡形式的细胞死亡方式，由 Dixon 等[26]在RAS(rat sarcoma)选择性小分子药物研究中提出，是一种具有铁离子依赖性、氧化型的细胞死亡方式。铁死亡主要聚焦于肿瘤、神经系统等疾病的发生方面。Yagoda 等[27]在 K-ras 突变的 A549 肺癌细胞中发现铁死亡。近年来文献报道，野生型和突变型的 p53 均可以在 ROS 累积的条件下，通过抑制细胞表面氨基酸运载蛋白的表达，阻止细胞摄取胱氨酸诱导细胞铁死亡[28]。

作为ncRNA的大型异质子类，lncRNA在肿瘤发生的不同方面起着不可或缺的作用，被认为是癌症诊断和预后的新型生物标志物[29]。没有关于铁死亡相关lncRNA信号来预测肺鳞癌患者生存的系统研究。因此，有必要建立铁死亡相关的lncRNA信号，以基于大规模数据库来预测LUSC患者的预后。

在这项研究中，通过构建lncRNA和铁死亡相关基因的共表达网络来筛选铁死亡相关的lncRNA。此外，利用套索回归和Cox回归获得以下4种预后铁死亡相关的lncRNA：AC253536.6，FLJ46906，LUCAT1和AC022150.2。4个铁死亡相关的lncRNAs可能是LUSC患者预后的分子标志物和潜在的治疗靶标。目前这4个铁死亡相关的lncRNAs未见相关研究。

基于4个铁死亡相关的lncRNA的签名显著预测了LUSC患者的预后，低风险组具有比所述高风险组的生存时间更长。ROC曲线下对应于7年的值为0.726。该结果表明，风险评分在预测生存率方面具有一定潜力。单变量和多变量Cox分析均显示该特征可以用作独立的预后指标。根据C-指数，ROC曲线和校正曲线，该模型具有更好的判别力和准确性，表明该模型可作为LUSC患者的潜在预测工具。

铁死亡在抗肿瘤治疗中有很大潜力，为一些药物的临床效用研究提供了新途径，起到老药新用、新药再用的效果。但是仍有很多问题尚待研究，如铁死亡激发机体免疫原性引发机体适应性的具体发生分子机制目前仍不清楚;在铁死亡发生机制中，具体哪些脂类物质被氧化，以及在分子水平是通过何种方式与其他细胞死亡形式相互作用等问题亟待解决。对铁死亡的深入研究有助于更充分认识相关疾病的发生进展机制。铁死亡抑制剂在一定程度上能够延缓疾病进程，减轻患者病情，这可能作为今后基础机制研究和临床应用的切入点，在肿瘤的治疗和预防中发挥作用。随着肺癌检出率的提高，在原有的手术、化疗、放疗、分子靶向、免疫治疗等治疗基础上，更多新的有效治疗不断被挖掘。

当前的研究存在一些局限性。首先，本研究的数据来源单一，所包含的数据量不大，因此分析结果可能存在一定偏差。其次，我们的研究是一项回顾性研究，需要更多的前瞻性研究来证明铁死亡相关信号的预后功能。第三，为了确保预后模型的鲁棒性，我们需要在其他独立队列中进一步确认我们建立的模型的预后模型，以确保其准确性。第四，应该进行功能性实验以进一步表明预测铁死亡相关lncRNAs效应的潜在分子机制。

铁死亡相关的lncRNA共表达网络为揭示LUSC中铁死亡相关的lncRNA功能提供了宝贵的资源。4个铁死亡相关的lncRNA被认为与LUSC患者的生存显著相关。由4个铁死亡相关lncRNA组成的铁死亡相关lncRNA标记用于区分处于不同风险的患者，它是LUSC患者的显著独立因素。因此，4种铁死亡相关的lncRNAs及其标记可能是LUSC患者的分子生物标志物和治疗靶标。