杜仲种质资源叶片表型性状多样性分析

孟益德，杜红岩，王 璐，吕庚鑫，庆 军，何 凤，黄海燕，杜庆鑫*

(1. 中国林业科学研究院经济林研究所，河南 郑州 450003；2. 国家林业和草原局杜仲工程技术研究中心，河南 郑州 450003；3. 河南润友林业技术服务有限公司，河南 郑州 450003)

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.） 为杜仲科杜仲属落叶乔木，栽培与利用的历史长达两千多年，是第四纪冰川侵袭后仅留存在我国的单属种孑遗树种，也是目前我国重要的经济林和工业原料林树种，属国家二级保护野生植物，在国内29个省（区、市）均有种植[1]。杜仲叶富含多种化学成分，包括黄酮类、环烯醚萜类、苯丙素类、木脂素类等，具有很高的药用价值[2]。此外，杜仲叶在功能食品、保健品及功能饲料等领域也有广阔的应用[3]。2018年，杜仲叶拟被国家卫健委会列为药食同源目录[4]。

植物叶片表型特征与植物生理生化及繁殖特征具有密切的相关关系，直接影响植物的基本行为与功能[5-6]。因此，叶片表型性状多样性是遗传多样性的具体表现，研究叶片表型遗传多样性有助于了解物种遗传规律和变异程度，尤其是对种质资源收集、保存、评价与利用等具有重要意义[7-9]。研究表明，在器官形态上不同种质杜仲表现出明显的变异，根据叶色和叶形发现有紫红叶、小叶、大叶及长叶柄等变异类型，根据枝条形态发现有短枝、龙拐杜仲等变异类型，杜仲叶片主要活性物质含量及橡胶含量也发现有显著的差异[10-12]。

近年有关杜仲种质资源遗传多样性研究已有报道，主要集中在雄花和果实形态性状多样性[13-14]，雄花和叶片活性成分多样性[15-16]及采用分子标记技术对杜仲种质资源遗传多样性和群体遗传结构进行研究[17]；但关于杜仲种质资源叶片表型性状遗传多样性尚未开展系统研究，在表型特征中，叶片变异是遗传变异的重要体现[18]。本文以701份杜仲种质资源叶片为研究对象，对 14个表型性状进行测定，通过多样性分析、相关性分析、聚类分析、随机森林类群分类预测等方法，旨在系统全面揭示杜仲种质资源叶片表型性状遗传变异规律，以期为杜仲优良资源选育和优异性状的挖掘提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

701份供试材料来自中国林业科学研究院经济林研究所杜仲种质资源库（113°36′ E，34°55′N），种质资源库采用6株小区，定植株行距 3 m ×3 m，其栽培立地条件及管理方式均一致。于2019年7月初对资源库8年生杜仲成熟叶片进行采集，每份种质选择长势一致、无病虫害的4～6株，每株均从东南西北4个方向选取中部枝条，采取各枝条中部新鲜成熟叶片30片，低温冷藏带回实验室进行表型性状测定与分析。种质来源与数量见表1。

表1 种质来源与数量Table 1 Number and origin of germplasm resources

1.2 测定方法

鲜比叶质量：用直径1 cm的打孔器在10个叶片上打取50个圆片，电子天平称量；干比叶质量：50个鲜圆片烘干后的质量；叶片含水量：50个鲜圆片质量与相应50个干圆片质量之差；节间距：量取枝条的长度和叶痕总数，枝条长度与相应叶痕总数的比值，量取5根枝条取平均值；叶柄长：用游标卡尺测量10个叶片取平均值；用万深LA-S植物叶片图像分析仪（杭州万深检测科技有限公司）测量叶片长、叶片宽、长宽比、叶面积、叶片红色成分、叶片蓝色成分、叶片绿色成分、叶绿素参考值、叶周长，测量10个叶片取平均值。RGB颜色模型是一种颜色标准，本文通过采用RGB系统模型中的红色成分、蓝色成分、绿色成分描述叶片颜色特征[19]。

1.3 数据统计与分析

叶片14个表型性状的最小值、最大值、平均值、标准差、变异系数和遗传多样性指数用 Excel软件进行处理和计算。遗传多样性指数用Shannonwiener指数（H'）表示，，其中，Pi为某一性状第i级别试验材料份数占总份数的百分比。根据平均值（μ）和标准差（σ）将各性状划分为10级，从第1级（Xi<μ- 2σ）到第10级（Xi≥μ+2σ），每0.5σ为1级，统计各级的分布频率[20]。基于杜仲14个表型性状，利用R统计软件进行相关性分析和主成分分析[21]，采用ward.D2系统聚类对杜仲种质资源进行聚类，聚类方法采用平方欧氏距离，通过R扩展软件包randomForest来实现表型性状数据随机森林建模[22]。

2 结果与分析

2.1 杜仲种质叶片表型性状多样性分析

在701份供试的杜仲资源中，各表型性状最小值、最大值、平均值、标准差、变异系数、多样性指数存在不同程度的差异（表2）。 14个表型性状的遗传多样性指数分布在1.90～2.09之间，平均多样性指数为2.04，其中，叶片长和叶柄长的遗传多样性指数最高（2.09），其次是叶片宽、叶周长、长宽比，含水量的遗传多样性指数最低（1.90）。

表2 杜仲种质资源叶片表型性状统计分析Table 2 Statistical analysis of leaf phenotypic traits of Eucommia ulmoides germplasm resources

14个表型性状存在不同程度的变异，变异系数为4.57%～20.68%，平均值为11.41%，其中，叶面积、叶柄长和节间距具有较大的离散程度，叶面积的变异系数最大（20.68%），是叶片表型性状变异程度最大的性状，最大值为最小值的3.9倍，叶绿素参考值变异系数最小，为4.57%。

2.2 不同来源杜仲种质叶片性状分析

不同来源杜仲叶片14个性状平均值、标准差和多重比较（样本数大于10）结果（表3）表明：14个表型性状在不同来源间均有显著差异存在。山西杜仲资源叶片的叶绿素参考值、鲜比叶质量和干比叶质量最大、含水量最高，叶片蓝色成分最小；湖北杜仲资源的长宽比最大；四川杜仲资源的节间距、叶片长、叶片宽、叶面积和叶周长最大，鲜比叶质量最小，含水量最低；江苏杜仲资源的叶片绿色成分、红色成分最大，但其干比叶质量、叶片长、长宽比、叶面积、叶绿素参考值和叶周长均最小；河南种质资源的叶柄最长，湖北种质的叶柄最短。

表3 不同来源地杜仲叶片性状比较（均值±标准差）Table 3 Comparison of leaf traits from different origin among Eucommia ulmoides germplasm (Mean±SD)

2.3 杜仲种质叶片表型性状相关性分析

叶片14个性状的相关性分析结果（表4）表明：84对性状组合中有45对组合的相关性达极显著水平（P＜0.01），其中，呈极显著正相关的有26对，呈极显著负相关的有19对；鲜比叶质量和含水量间的正相关系数最大（0.928），叶片绿色成分和叶绿素参考值间的负相关系数最大（-0.637），其中，鲜比叶质量与干比叶质量、含水量，叶面积与叶片长、叶片宽，叶周长与叶面积、叶片长、叶片宽，叶片红色成分与叶片绿色成分这8组性状的正相关性极高，相关系数均在0.80以上。叶面积与节间距、叶片长、叶片宽、叶绿素参考值、叶周长、叶柄长6个性状呈极显著正相关，与长宽比、叶片红色成分、叶片绿色成分3个性状呈极显著负相关。叶绿素参考值与干比叶质量、叶片长、叶片宽、叶面积、叶周长、叶柄长6个性状呈极显著正相关，与叶片红色成分、绿色成分、蓝色成分3个性状呈极显著负相关。叶柄长除与含水量、长宽比、叶片蓝色成分相关性不显著外，与鲜比叶质量、干比叶质量、含水量等10个性状呈显著相关（P<0.05）。

表4 杜仲种质资源叶片14个表型性状相关性分析Table 4 Correlation analysis of 14 phenotypic traits in leaves of Eucommia ulmoides germplasm resources

2.4 杜仲种质叶片表型性状主成分分析

对14个表型性状主成分分析（表5）发现：前6个主成分特征值均大于1，且累积贡献率达到89.211%，说明前6个主成分能解释绝大部分杜仲叶片性状变异。第1主成分中，叶面积的正向特征向量最大，为0.951，其次为叶周长、叶片长、叶片宽，分别为0.933、0.900、0.899，这些性状主要与叶片大小有关。第2主成分中，鲜比叶质量正向特征向量最大，为0.998，其次是含水量、干比叶质量，分别为0.912、0.857，这些性状主要与叶片水分含量和质量有关。第3主成分中，叶片绿色成分正向特征向量最大，为0.948，其次是叶片红色成分，为0.938，主要与叶片颜色有关。第4主成分中，叶绿素参考值正向特征向量最大，为0.603，代表了叶片的光合作用，叶片蓝色成分负向特征向量最大，为-0.972。第5主成分中，长宽比正向特征向量最大，为0.994，主要反映叶片的形状。第6主成分中，节间距正向特征向量最大，为0.831。从14个性状中提取出叶面积、鲜比叶质量、叶片绿色成分、叶绿素参考值、长宽比、节间距6个叶片表型性状，这些性状是导致杜仲种质叶片表型性状差异的主要因素，可作为杜仲种质资源的评价指标。

表5 701份杜仲种质资源表型性状主成分分析Table 5 Principal component analysis of phenotypic traits of 701 Eucommia ulmoides germplasm resources

2.5 杜仲种质叶片表型性状聚类分析

根据14个表型性状，将701份杜仲种质划分为4个类群（图1），其中，第I类群包含的种质最多，有209份种质，其次是第Ⅳ类群有203份种质，第Ⅱ类群有178份种质，第Ⅲ类群有111份种质。分析4个类群杜仲种质资源的14个叶片表型性状（表6）发现：每个类群之间杜仲种质资源叶片的表型性状存在较大差异。第Ⅰ类群节间距、叶片长、叶片宽、叶面积、叶周长等形状均显著高于其他类群种质，第Ⅱ类群鲜比叶质量、干比叶质量、含水量均显著高于其他类群种质，第Ⅲ类群叶片长、叶片宽、长宽比、叶面积、叶周长和叶柄长均显著低于其他类群种质，第Ⅳ类群中叶片红色成分、绿色成分显著高于其他类群种质。

表6 杜仲种质资源各类群表型性状比较Table 6 Comparison of phenotypic traits of various groups of Eucommia ulmoides germplasm resources

图1 701份杜仲种质资源聚类Fig. 1 Clustering of 701 Eucommia ulmoides germplasm resources

2.6 杜仲种质不同类群分辨

利用鲜比叶质量、叶片绿色成分、叶面积、叶绿素参考值、节间距、长宽比6个叶片表型性状建立随机森林判别模型，对4个类群进行分类预测，从701份杜仲种质中选出75%的样本作为训练集，25%的样品作为独立测试集。利用随机森林算法对训练集进行训练构建预测模型, 模型节点变量数为4，随机森林中的数目为500，其交互验证的预测准确率为80.11%，初建的随机森林模型有待进一步优化。通过调整模型节点变量数优化随机森林模型，根据模型误判率均值确定模型节点变量数，当节点变量数为1时，模型误判率均值为17.61%最低，预测准确率均值为82.39%（表7），因此，模型节点变量数选取为1。基于随机森林分类输出的杜仲叶片表型性状重要程度见表8，平均降低精度重要性依次为：鲜比叶质量>叶片绿色成分>叶面积>叶绿素参考值>节间距>长宽比。建立的随机森林判别模型能够有效区分各类群种质，并验证了这6个叶片表型可作为杜仲种质资源的评价指标。

表7 不同类群的杜仲种质分类预测结果Table 7 Prediction results of germplasm classification of Eucommia ulmoides of various groups

表8 叶片6个表型性状对各类群分类预测的重要性Table 8 Importance of the six phenotypic traits in leaves for classification of various groups

3 讨论

种质资源是育种的物质基础，研究叶片表型性状可以从整体水平了解研究对象的变异和多样性，推动种质资源创新[23-24]。本研究通过对701份杜仲种质资源14个叶片表型性状进行分析，发现不同种质杜仲叶片表型性状间存在较大遗传变异。表型变异系数越大，离散程度越高，14个性状变异系数为4.57%～20. 68%，其中，叶面积的变异系数最大，为20. 68%。多样性指数分布在1.90～2.09之间，叶柄长和叶片长的多样性指数最高（2.09）。多样性指数越高表明表型性状多样性越丰富，杜仲叶片表型性状的Shannon-Wiener指数（H'）均值为2.04，与格木（Erythrophleum fordiiOliv.）[25]表型多样性指数（2.03）和滇楸（Catalpa fargesiiBur. f.duclouxii（Dode） Gilmour）[26]表型多样性指数（1.92）接近。综合表型性状的变异系数、多样性指数，叶柄长和叶面积呈现出明显的遗传差异，这与卫尊征[27]等对小叶杨（Populus simoniiCarr.）叶片性状研究中叶柄长变异系数最大，叶面积次之结果相似。

杜仲14个叶片表型性状之间存在着不同程度的相关关系，其中，叶片长、叶片宽、叶面积、叶周长、叶柄长5个性状间均呈极显著正相关，叶柄长除与长宽比、叶片蓝色成分相关性不显著外，与鲜比叶质量、干比叶质量、含水率、节间距等11个性状呈显著相关。叶片性状间复杂的相关性可能是因为数量性状受多基因控制所致[28]。主成分分析将杜仲种质叶片的14个表型性状转化为6个主成分，这6个主成分提供了原性状89.211%的信息。张康健等[29]发现，叶形和叶面积可作为筛选高含胶杜仲无性系的重要选择指标。本研究中叶面积、鲜比叶质量、叶片绿色成分、叶绿素参考值、长宽比、节间距是6个主成分的主导因子，对叶片表型性状多样性起主要作用，可作为杜仲种质资源评价的主要表型指标。

对杜仲种质资源叶片14个表型性状进行聚类分析，701份材料聚类为4类，4个类群杜仲种质叶片14个表型性状均存在较大差异。杜仲在我国有长期的引种栽培历史，不同杜仲群体间基因交流程度较高，而遗传分化水平则较低[14]。聚类结果显示，同一地区的杜仲种质并没有完全聚在一起，说明杜仲种质之间的遗传差异性与种质来源没有相关性，因此，推测杜仲种质资源叶片表型的遗传变异与种源地的关系不显著，叶片发生的变异可能是源于杜仲群体内的遗传多样性。随机森林算法可以找到数据中重要的特征，同时利用这些重要特征构建模型用于分类预测或者回归预测[30]。Yuan等[31]采用随机森林建立的模型对枯萎病发病和健康土壤的微生物群落特征进行了良好的区分。利用叶面积、鲜比叶质量、叶片绿色成分、叶绿素参考值、长宽比、节间距6个性状建立随机森林判别模型，对不同类群的杜仲种质进行分类判别，能够有效区分各类群的种质，说明这6个叶片表型是造成杜仲种质资源叶片表型差异的主要因素，检验了这些性状可作为杜仲种质资源评价的主要表型指标，为叶用杜仲良种选育及综合利用提供了优异的种质基础。

4 结论

本研究选取的701份杜仲种质涵盖了国内绝大多数分布区，最大程度包含了杜仲叶片的遗传多样性类型。通过对杜仲种质资源叶片14个表型性状进行分析，发现杜仲种质资源叶片表型性状存在较大变异和丰富的遗传多样性，14个表型性状之间存在着不同程度的相关关系。聚类分析将杜仲种质划分为4大类群，各类群叶片表型性状存在较大差异。主成分分析筛选出叶面积、鲜比叶质量、绿色成分、叶片叶绿素参考值、长宽比、节间距6个叶片表型性状可作为评定杜仲资源的主要指标，为叶用杜仲良种选育及综合利用提供了优异的种质基础。