一种黑腹果蝇原种的培养方法

2022-10-12王竹林

甘肃科技 2022年17期

胡甘，孟敏，王竹林

（西北农林科技大学，陕西杨凌 712100）

黑腹果蝇是遗传学研究与教学的经典实验材料之一[1-3]。1908年遗传学家摩尔根在实验室内培育并对它进行系统的研究，随之把它带入了经典遗传学的研究领域中，用它作为材料证实了孟德尔遗传规律，此外还发现了果蝇白眼突变的性连锁遗传规律，提出了基因在染色体上直线排列及连锁交换的规律，并被广泛应用。在现代生态学、群体生物学、系统学、行为学、基因组学、发育生物学和分子生物学研究领域，果蝇作为遗传学模式生物材料也得到了广泛的应用[4]，主要是因为果蝇以其生活史短、易于饲养、繁殖量大、染色体数目少、变异类型多等优点成为生命科学研究中最重要的模式动物。如基因编辑技术、新一代转基因RNAi技术等。

在高等院校遗传学教学过程中，用果蝇作为实验材料的项目有：果蝇实验技术、果蝇唾腺染色体观察、果蝇杂交大实验室的讨论等，占遗传学课程开设实验总项目数的35%[5]，是农科、生物及医学类各专业本科学必做的典型实验。然而，在果蝇培养过程中常会出现培养基污染、长势弱、羽化数量少等问题，因此，获得良好的实验材料是实验成功的关键，即材料质量越高，实验成功率就越高。本实验室对果蝇材料培养方法做了合理改进，取得了良好的实验教学效果。

1 果蝇原种培养基组成及基本配制方法

1.1 培养基组成

果蝇首要食物来源于水果腐烂的微生物及其他发酵的有机物，如：酵母菌和细菌等，其次是以含糖的水果为食物，喜欢营养物质丰实和温暖湿润的生存环境。西北农林科技大学遗传工程实验室所需原料成分及数量如表1所示：

表1 培养基的组成成分

1.2 培养基制备

配制时，先将水分成两份，其中一份用于煮溶琼脂和蔗糖，另一份煮溶玉米粉，待两份分别溶解煮好后再合到一起煮沸至稠糊状，期间不断搅拌，防止糊底，去火后再加酵母粉和丙酸。然后，将粘稠的培养基充分搅拌后再分装在50 mL三角培养瓶中，厚度2 cm左右，把灭菌的粗滤纸剪成小方块折叠成扇面状（缩短三龄幼虫化蛹时间，羽化成虫多），插入培养基中间，加盖棉塞，在0.11 mp、121 ℃下灭菌15 min[6]，待培养基冷却后，即可分装果蝇。冷却后的培养基也可放入冰箱冷冻层中保存，接种时取出，置于桌面上自然解冻，随后分装果蝇。长期保存我们选用高压灭菌然后冷冻的方法，现配现用。25 ℃发酵2～3 d，分装果蝇，此方法适用扩大原种种群，进行一系列实验材料的培养。缺点是易污染和干燥。因此，只能短期使用，最好使用一代，随即弃之。

2 果蝇原种的培养方法

（1）接种。接种前，将配制好的培养基放在25 ℃培养箱中，待1～2 d后酵母菌大量繁殖，创造果蝇营养物质丰富的生存环境，随后仔细检查品种是否出现混杂。用75%酒精喷洒超净工作台，擦拭双手及操作器械，在无菌条件下，将12 h以内羽化出的果蝇培养瓶与麻醉瓶口对口相接，麻醉瓶在下培养瓶在上，轻拍瓶壁震落果蝇[7]。此后，从麻醉瓶口滴入2～3滴乙醚，轻轻晃动，轻度麻醉。0.5 min后[8]果蝇整体昏迷，迅速倒在白瓷板上，选取个体较大，性状具有本品种特征明显的雌雄果蝇各5只，用毛笔扫入侧倒的新制培养瓶中配对繁殖，待清醒后，竖立加塞，防止原种粘附在培养基上死亡。每个品种至少保留两套[9]，注明名称和时期。随后将剩余果蝇立即投入装有70%酒精的死蝇瓶中。

（2）培养。原种保存必须在单独的环境中分房、分箱独立培养，温度是控制生长发育和培养基使用时间的唯一手段。将果蝇原种置于25 ℃培养箱中有光培养3～4 d，在适宜温度下雄蝇不停飞舞，表现活跃。寻求交配，产卵。大量的虫卵产于培养基表面后，温度调至18 ℃继续培养，延长幼虫生长周期，使其充分的生长发育和吸取营养物质，达到育肥的目的[10]。培养温度不同，培养基消耗程度就不同，后期的营养成分殆尽。应减少转接次数，防止品种混杂的概率。一般4周左右更换培养基，这样才能保证原种长期性、连续性地健康生长。果蝇生长规律详见表2。

表2 25 ℃果蝇发育过程及现象

果蝇在不同温度下生长速度是不同的，高温生长快，消耗的食物也多，果蝇在不同温度下消耗培养基时间大致规律如图1所示。

图1 果蝇在不同温度下消耗培养基时间

3 常见问题处理

3.1 培养基发霉

原种在保存过程中，由于长期在培养箱中进行，通风不良，时间久易滋生霉菌。霉菌生长快，活性强，不易剔除，并迅速蔓延。一旦发现培养基小面积污染，可用酒精火焰灭菌过的接种环将霉菌斑挑出，剔除的范围相对大一些。操作时注意动作轻缓，避免霉菌孢子漂浮于培养瓶的整个空间[11]，然后观察48 h，确认除去污染即可。若染上霉菌，将带有霉菌孢子成蝇倒入灭菌过的空培养瓶中，棉塞上滴适量75%酒精，利用其挥发性，使其充满整个瓶内，时间2 h为宜，第二天再次把果蝇转另一新培养瓶中，反复5～6次，过程同样。然后倒入装有培养基瓶中，观察48 h。如果是培养瓶内大面积污染，此原种必须停止使用，立即淘汰。

3.2 培养瓶内壁出现水珠

培养基分装到培养瓶时热蒸汽会凝结在瓶壁，冷却后，产生水珠。使用前若发现瓶壁沾有水珠，则需要用灭菌滤纸条吸干或用灭菌干棉球擦干，以免移入的果蝇被粘住溺死。

3.3 培养基干结

配制的培养基放置时间过久或培养温度较高时，培养基因为失水与瓶壁分离，干结成块，影响果蝇正常生存，无法产卵，出现寿命短、长势弱、无后代的情况。可用灭菌过的蒸馏水，使用移液器适量加入培养基与瓶壁分离处[12]，达到其生长环境60%的湿度。

3.4 培养基过稀

如果在培养基制备过程中没有掌握好原料煮沸的稀稠，灌装灭菌后，培养基冷却，干结程度不够。可采用将培养瓶放入30 ℃培养箱中，脱水2～3 d，时间自行掌握。达到一定的干湿度，接入原种。培养的过程中出现培养基渗出多余的水分，可用灭菌干棉球贴压表面，吸走多余水分。避免果蝇粘附在培养基表面，无法飞行和觅食而死亡。

3.5 原种复壮

由于果蝇长期在无通风且相对偏低的温度下保存，使其活力下降，性状出现退化，表现在体色减弱，性功能衰退，幼虫体内产生寄生虫（将幼虫身体解剖，平拉开，镜检），影响身体健康。因此，每次接移原种，都要采取刚羽化的成虫作为原种来保存。

3.6 品种死亡丢失

在培养保存原种的长期过程中，由于环境和人为多方面因素，造成果蝇死亡，品种丢失，可采取杂交选纯的方法来恢复本品种。前提条件是必须存在一定的性状资源。通过选取所需性状杂交，对其后代F1相同性状的处女蝇不断筛选、繁殖，直至完全纯合，获取你需要的品种资源。否则需引种。这一方法也适用果蝇新品系开发，扩大种质资源库，为教学和科研提供丰富的材料来源。