microRNA-103通过调节自噬参与调控妊娠期糖尿病机制的临床研究

郭美妹

妊娠期糖尿病是一种妊娠期独有的疾病，也是产科的一种常见并发症，指孕妇首次出现不同程度的糖代谢异常或葡萄糖不耐受[1]。该病具有较高的发病率，近几年随着孕妇年龄、生活方式、饮食习惯等的变化，导致其发病率出现了逐渐升高的发展趋势[2]。妊娠期糖尿病的危害性大，会导致孕妇出现代谢功能紊乱，引发子痫前期、产后出血、产褥感染等并发症，也会影响胎儿发育及新生儿的健康生长，可出现过期产儿、胎儿宫内窘迫、巨大儿、新生儿窒息、新生儿低血糖等不良后果[3-5]。而该病的发病机制尚不明确，可能和糖代谢异常、胰岛素功能障碍、遗传、炎症反应、环境等因素有关，且通常是多种因素共同作用的结果[6-7]。近期有研究发现，妊娠期糖尿病患者有诸多具有重要功能的基因表达出现异常变化，但其核酸序列并未出现变化，而是通过表现遗传学机制参与了疾病的发生与发展[8]。microRNA 是当前分子生物学与生物信息学的热门领域，因其具有广泛参与生物学过程的特征，使其在内分泌代谢领域中获得了长足的进展[9]。有报道指出，microRNA 在妊娠期糖尿病的病理生理变化过程中起到了非常重要的作用，但其作用机制尚未阐明[10]。自噬是一种对细胞成分降解再利用的过程，在细胞生存中发挥着非常重要的作用[11]。正常状况下，自噬可对细胞应激产生保护作用，但自噬过度会导致细胞损伤[12]。microRNA-103参与调节自噬的研究在近期引起了广泛关注，其是否通过调节自噬参与了调控妊娠期糖尿病机制的研究尚未见报道。为此，本研究为了进一步探讨microRNA-103 通过调节自噬参与调控妊娠期糖尿病的作用机制，对比分析了妊娠期糖尿病患者与正常孕妇胎盘组织的microRNA-103 表达水平及自噬情况，旨在为妊娠期糖尿病寻找新的基因靶向治疗方法提供线索，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年8 月-2021 年8 月于莆田学院附属医院产科住院分娩的30 例妊娠期糖尿病孕妇纳入研究组，另选取同时期住院分娩的30 例健康孕妇纳入对照组。纳入标准：（1）年龄20～42 岁；（2）经实验室检查、影像学检查等证实为宫内妊娠；（3）研究组孕妇经葡萄糖耐量试验证实为糖代谢异常，满足文献[13]《妊娠合并糖尿病诊治指南（2014）》中的相关妊娠期糖尿病的诊断标准；（4）定期产检并在本院住院足月分娩。排除标准：（1）资料不完整；（2）合并高血压；（3）合并其他代谢性疾病，如营养不良、肥胖等；（4）其他内分泌疾病，如甲状腺功能异常等；（5）主要脏器疾病；（6）严重慢性病或传染性疾病；（7）全身免疫性疾病；（8）曾接受不孕治疗，包括体外受精或宫内人工授精等；（9）精神疾病、神志不清、认知功能障碍、沟通障碍；（10）恶性肿瘤。该研究已经过医院伦理委员会批准，自愿参加研究，并经家属同意，签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本取材与处理 产妇分娩后立刻在其胎盘母体面小叶处剪取小块组织，分为四份，聚丁二酸丁二醇酯缓冲液洗净，置于2 mL 的冻存管内，于-80 ℃下储存，以10%甲醛固定。

1.2.2 主要试剂与仪器 Trizol 试剂，源于美国Invitrogen 公司；microRNA 分离试剂盒，源于Ambion 公司；逆转录试剂盒，源于上海吉玛制药技术有限公司；microRNA-103 引物，源于上海吉玛制药技术有限公司；聚合酶链式反应试剂盒，源于美国PE-Cetus 公司；蛋白抗体，源于Milipore 公司；Tecnai G2 12 透射电镜（荷兰FEI 公司）。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链式反应 运用实时荧光定量聚合酶链式反应法测定microRNA-103 表达水平，严格按照Trizol 试剂盒说明书操作。运用Trizol 法提取胎盘组织的总RNA，运用QuantiMir反转录试剂逆转录为小RNA 的cDNA（25 ℃，30 min；42 ℃，30 min；85 ℃，10 min）。cDNA 运用SYBR Seclect Master Mix 系统进行实时荧光定量聚合酶链式反应法检测microRNA-103 表达，以GAPDH 为内参。microRNA-103 的特异性引物为：上 游5’-CGAGCTCCTCTGAAGCAAAT-3’，下 游5’-AACCTAGCAATGGCACAGAAA-3’。聚合酶链式反应体系（20 μL）：cDNA 模板2 μL、上下游引物（25 mmol/L）各1 μL、SYBR Seclect Master Mix 10 μL、ddH2O 0.6 μL；95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃34 s；循环40 个。各个样本均设定3 个复孔，取平均值进行统计分析。为了确保扩增效率的一致性，microRNA-103 的相对表达量以2-ΔΔCT进行计算。

1.2.4 蛋白质印迹法 运用蛋白质印迹法检测胎盘组织微管相关蛋白1 轻链3Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相关蛋白5（Atg5）蛋白表达水平。取待测组织蛋白样本20 μg，添加缓冲液，沸水煮5 min，取出后马上置于冰上5 min，完成蛋白样本变性；变性后样本马上上样或放于-80 ℃下保存。制备12%（wt/vol）的SDS 聚丙烯酰胺凝胶；连接垂直电泳装置。蛋白样本上样，在SDS 聚丙烯酰胺凝胶中稳压（80～110 V）电泳1.5～2.0 h；停止电泳，撤掉电泳装置，取下凝胶，让其和聚偏二氟乙烯膜贴合，转移到转膜夹层装置，放在转膜槽上。根据测定蛋白分子量计算转膜时间，在电泳200 mA、4 ℃下将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。停止转膜后，将膜放于Western 洗涤缓冲液中洗膜2 次，10 min/次，再用含5%脱脂奶粉的Western 洗涤缓冲液于室温下封闭1～2 h。停止封闭后将膜放在Western 洗涤缓冲液中洗膜3 次，5 min/次。加入稀释度1∶400 的相应一抗抗体，4 ℃过夜，加入AP 标记的相应二抗抗体IgG（1∶5 000），室温下孵育2 h。停止一抗孵育后，拿出聚偏二氟乙烯膜，放在Western 洗涤缓冲液中，室温下洗膜6 次，10 min/次。添加针对一抗的辣根过氧化物酶偶联的二抗，室温下放在摇床孵育，轻轻晃动2 h。停止孵育后，以Western 洗涤缓冲液于室温下洗膜3 次，10 min/次。将孵育好的聚偏二氟乙烯膜置于现配的ECL 工作液中，室温下温育2～5 min，于暗室内曝光。运用Image J 软件对蛋白质印迹结果的灰度值进行数据分析。

1.2.5 电镜检测 应用电镜检测组织自噬小体。将胎盘组织用聚丁二酸丁二醇酯缓冲液冲洗，用2%戊二醛（聚丁二酸丁二醇酯配制）固定胎盘组织2 h，之后进行传统透射显微镜准备，应用Tecnai G2 12透射电镜进行检测。

1.3 观察指标（1）比较研究组与对照组胎盘组织microRNA-103、LC3-Ⅱ与Atg5 蛋白的表达水平。（2）比较研究组与对照组胎盘组织中的自噬小体数量。（3）运用Pearson 相关性分析法分析观察组LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白与microRNA-103 的相关性。

1.4 统计学处理 运用SPSS 21.0 软件，计量资料用（）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验；相关性分析运用Pearson 相关性分析法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 研究组孕妇年龄20～42 岁，平均（29.37±5.98）岁；孕周37～41 周，平均（38.12±1.06）周；体重指数20～31 kg/m2，平均（26.52±2.30）kg/m2；产次0～3 次，平均（1.43±0.52）次；单胎28 例，多胎2 例；合并糖尿病家族史6 例。对照组孕妇年龄20～42 岁，平均（29.34±6.00）岁；孕周37～41 周，平均（38.10±1.09）周；体重指数20～31 kg/m2，平均（26.55±2.28）kg/m2；产次0～3 次，平均（1.45±0.50）次；单胎28 例，多胎2 例；合并糖尿病家族史5 例。两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 两组胎盘组织microRNA-103、LC3-Ⅱ与Atg5 蛋白的表达水平比较 研究组胎盘组织中的microRNA-103、LC3-Ⅱ与Atg5 蛋白的表达水平均高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组胎盘组织microRNA-103、LC3-Ⅱ与Atg5蛋白的表达水平比较（）

表1 两组胎盘组织microRNA-103、LC3-Ⅱ与Atg5蛋白的表达水平比较（）

2.3 两组胎盘组织中的自噬小体数量比较 研究组胎盘组织中的自噬小体数量为（83.27±6.30）个，多于对照组的（24.84±1.68）个，差异有统计学意义（t=49.084，P＜0.05）。

2.4 观察组LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白与microRNA-103的相关性 观察组LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白与microRNA-103 均呈正相关（P＜0.05）。见表2。

表2 观察组LC3-Ⅱ蛋白、Atg5蛋白与microRNA-103的相关性分析

3 讨论

妊娠期间，胎盘会产生胎儿所需的各类激素，而激素分泌的同时也会影响母体胰岛素的全身脂解能力及降糖能力，所以会导致妊娠期糖尿病发生风险的升高[14]。随着孕周增加，孕妇机体中的抗胰岛素样物质会不断增多，对胰岛素的敏感度随之降低，血糖水平则进一步升高，糖代谢异常因而加重，会形成恶性循环[15]。妊娠期糖尿病对母婴健康会产生不利影响，严重时可危及母婴生命安全，应引起高度重视，及早诊治[16]。

microRNA 是一种由19～23 个核苷酸形成的微小非编码RNA，普遍存在于真核生物细胞中，是最大的基因家族之一[17]。microRNA 长约20～25 个核苷酸，对基因表达进行转录后水平的调控，可通过和靶基因的mRNA3’UTR 配对，直接剪掉靶mRNAs或抑制靶mRNA 的翻译，继而发挥调控细胞生物学行为的作用[18]。已有的研究报道指出，microRNA和诸多疾病的发生与发展密切相关，尤其是在癌症中，几乎所有癌症的发生与发展过程均能检测到microRNA 的异常表达[19]。另有研究报道指出，多种microRNA 在妊娠期糖尿病的发生与发展中发挥着重要作用[20]。microRNA-103 在肥胖型小鼠体内呈高表达状态，且沉默表达microRNA-103 可改善肥胖型小鼠的葡萄糖稳态，提高胰岛素的敏感度。本研究结果显示，研究组胎盘组织microRNA-103的表达水平高于对照组，提示妊娠期糖尿病胎盘组织中microRNA-103 的表达上调。

自噬是细胞正常的生命现象，在细胞生存中发挥着重要作用。近几年有研究发现，自噬贯穿于妊娠的整个过程，并参与了滋养细胞的分化、繁衍、侵袭，且维持着胎盘的正常功能与发育[21]。但细胞过度自噬会引起病理妊娠，导致不良妊娠结局的发生，如胎儿生长受限、早产等。LC3-Ⅱ与Atg5 是和自噬相关的两种蛋白，能够反映自噬活动。本研究结果显示，研究组胎盘组织中LC3-Ⅱ与Atg5 蛋白的表达水平与自噬小体数量均高于对照组，提示研究组胎盘组织的自噬能力增强。相关性分析结果进一步证实，LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白与microRNA-103 均呈正相关，提示microRNA-103 表达水平与自噬小体形成之间有密切的关联。因此，microRNA-103 在妊娠期糖尿病中可通过调节自噬参与疾病的发生与发展。

综上所述，microRNA-103 在妊娠期糖尿病胎盘组织中的表达水平上调，自噬增强，可通过调节自噬参与该病的致病过程。