蛋白质水解物在宠物食品中的应用及研究进展

曹秋梅 丁丽敏* 付小雨 张晓斌

(1.中国农业大学动物科学技术学院，北京100193；2.安贝(北京)宠物食品有限公司，北京100096；3.怀来安贝宠物食品有限公司，怀来075400)

蛋白质是宠物生长发育的物质基础，对保证机体代谢和维持组织细胞更新有非常重要的作用。目前，蛋白质水解物是宠物食品中应用较广泛的一种优质蛋白质饲料原料来源。通过水解动物性蛋白质产生的易于消化吸收的特定小肽和多肽可以促进宠物生长发育，降低宠物过敏反应，并提高宠物食品的适口性[1]。蛋白质水解物也是产生具有抗氧化和降血压等功能的生物活性肽的重要途径，对治疗宠物疾病、保证宠物健康和长寿有积极作用[2]。另外，我国蛋白质饲料资源短缺，宠物犬、猫对动物性蛋白质饲料原料数量和质量的需求也日益增高。通过蛋白酶解技术处理动物产品加工的副产品(以下简称“动物副产品”)生成蛋白质水解物，并利用其进行宠物食品的生产，不仅可以满足宠物犬、猫特定的营养物质需求，而且有益于提高蛋白质饲料资源利用率，增加动物副产品附加值，对于减少环境污染、实现可持续发展也有重要价值[3]。

1 蛋白质水解物概述

蛋白质水解物是蛋白质饲料在酸、碱、酶或微生物作用下产生的富含小肽、多肽和游离氨基酸等成分的混合物。与完整蛋白质相比，水解蛋白质可促进宠物消化道内蛋白质的消化和吸收，促进肽的产生和转化，提高血浆中氨基酸的利用率，是高度易消化吸收蛋白质的来源[4-5]。蛋白质水解可以产生有生理活性的肽段。水解大豆蛋白衍生的生物肽已被证明有免疫调节、抗氧化、降血压、降低胆固醇、抗癌等特性[6]。蛋白质水解物对于开发维持动物健康和生长的抗生素的替代品有重要意义。另外，水解蛋白质可以充分利用动物副产品(如内脏、血液、羽毛等)，为动物饲粮中动物副产品的应用提供了可能[7]。Grazziotin等[8]研究证实，微生物角化酶水解鸡羽毛粉(羽毛粉的蛋白质消化率低于10%)可使其蛋白质消化率提高5倍，而深度水解使羽毛几乎完全被消化。可用于水解的蛋白质原料一般包括鱼肉类、乳清蛋白、酪蛋白等动物性蛋白质和豆类、谷类等植物性蛋白质。由于犬、猫特定的蛋白质与必需氨基酸需要，动物副产品的蛋白质水解物是宠物食品中广泛使用的蛋白质来源，如酶解的鸡肉粉、肉骨粉、鱼粉、鸡肝粉等[9-10]。蛋白质的水解一般采用化学法、酶解法、微生物发酵法。酶解法由于反应条件温和、产物质量高，被认为是水解蛋白质的首选方法[7]。

2 蛋白质水解物的消化吸收

肽是蛋白质水解的主要产物。近年来，随着人们对肽营养及蛋白质周转代谢的深入研究，发现小肽可以通过肽载体被直接吸收进入血液循环，并且已经有研究证明，氮源以小肽形式组成的饲粮要比以氨基酸或完整蛋白质形式组成的饲粮蛋白质沉积效率高[11]。小肽在蛋白质营养过程中发挥重要的作用。蛋白质进入宠物消化道后，在消化道蛋白酶的作用下被分解，大部分会生成小肽，小部分生成氨基酸。游离氨基酸通过不同的钠离子转运系统逆浓度梯度主动运输进入肠细胞(耗能)。小肽与游离氨基酸进入肠细胞方式类似，是通过肠细胞顶膜上的肽转运载体小肽转运蛋白1(PepT1)被吸收(不耗能)。小肽被肠细胞摄入后，在肽酶作用下进一步水解，最终以小肽或游离氨基酸形式进入血液循环，参与宠物体内的代谢过程[12]。小肽具有特殊的营养生理功能，研究表明，小肽可以促进动物体内蛋白质的合成，提高矿物质的吸收速率，增强机体免疫力，维持肠道健康等[13]。小肽发挥作用的机制与其吸收特点有关。首先，在吸收速度上，小肠黏膜吸收以肽形式存在的氨基酸的速度要优于混合游离氨基酸；其次，小肽形式可以使一些不稳定和不溶性的氨基酸被吸收，如半胱氨酸、谷氨酸等，增加血液中氨基酸的利用效率，也使其更平衡。另外，与等量的游离氨基酸相比，小肠中细菌对小肽的分解代谢率低，有些肽还对动物胃肠道的形态和功能有一定的调节作用，如降低胃酸分泌、调节肠道菌群、免疫调节作用等[14]。

3 生物活性肽

蛋白质水解是产生生物活性肽的重要途径。生物活性肽中疏水性氨基酸含量高，分子质量小于6 000 Da，一般由2～20个氨基酸组成，也可能含有更多的氨基酸，如具有肽-C结构的胰岛素。生物活性肽具有类似激素功能，在降血压、抗氧化、抗菌、抗凝血、碳水化合物代谢等方面都发挥着重要作用[6]。

3.1 抗氧化

生物活性肽可以表现出比天然抗氧化剂，如α-生育酚，甚至合成抗氧化剂更好的抗氧化活性[15]。它们通过清除自由基、提供电子或螯合金属(如铁)而发挥抗氧化作用。一般来说，低分子质量(0.5～1.5 kDa)、结构上含有疏水性和芳香族氨基酸的肽具有较好的抗氧化活性。Wang等[16]研究发现，从鸭肉酶解中提取的多肽对自由基的清除能力强，具有较强的抗氧化活性。Chakka等[17]研究证实了鸡肝蛋白酶解肽与发酵肽均具有较好的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)及超氧阴离子自由基清除活性和还原活性。吴伟菁等[18]探究了不同蛋白酶水解苦荞蛋白对其产物抗氧化活性的影响，结果表明，随着水解程度的增加，水解产物抗氧化活性不断增强，是良好的抗氧化剂来源。吴明泽等[19]对中华圆田螺肉进行酶解制备抗氧化肽，并进行小鼠体内抗氧化酶活性测定试验，结果表明，分子质量<1 kDa的肽的抗氧化活性最强，分离出的混合物抗氧化肽纯度可达到90%。

3.2 抗菌

生物活性肽也具有抗菌活性。多肽的净正电荷使它们能够通过静电力与阴离子细菌膜通信，并在水介质中形成两亲性结构。因此，抗菌肽与微生物的最初相互作用是通过与脂质结合，渗透到细菌磷脂层，破坏细胞膜的通透性和结构，阻止细胞内核酸和蛋白质的合成，从而发挥抗菌作用的[20]。抗菌肽的抗菌活性与其理化性质以及氨基酸的数量和类型有关，多肽的理化性质，如其大小、电荷、疏水性、两亲性和溶解度等，对其抗菌活性至关重要[21]。具有抗菌活性的多肽通常富含阳离子和疏水氨基酸，具有阳离子(带正电)和两亲性(亲水和疏水)特征。Gómez-Guillén等[22]利用碱性蛋白酶从金枪鱼和鱿鱼皮的水解明胶中提取出具有抗菌和抗氧化活性的多肽，揭示分子质量较低的多肽具有较高的抗菌和抗氧化活性。Hedhili等[23]和Lafarga等[24]研究发现，牛血红蛋白水解物、牛肉肌浆蛋白水解物、鱿鱼皮蛋白水解物均含有抗菌肽，可作为治疗动物疾病的抗菌素或抗生素佐剂。虽然市场上有许多抗生素比这些抗菌肽具有更强的杀菌效果，但抗菌肽由于不产生抗药性、无残留、杀菌速度快、活性范围广而具有独特优势。

3.3 抗癌

蛋白质水解可以产生具有抗癌活性的多肽，这与其氨基酸组成、序列和长度有关。生物活性肽中短链的氨基酸和疏水氨基酸与抗癌活性有密切的关系。Halim等[25]使用碱性蛋白酶将鳗鱼肉酶解并通过膜过滤器(10、5和3 kDa)分级分离，结果表明，3 kDa鳗鱼蛋白水解物具有最高的脂质过氧化抑制能力、还原力、DPPH清除活性和抗癌活性。Sheih等[26]从藻类蛋白废料中提取出分子质量为1 309 Da的肽，发现其可以抑制胃癌细胞的生长并促进细胞周期停滞，表现出良好的抗癌活性。研究发现，牡蛎蛋白水解产生的分子质量为515.29 Da的肽序列Leu-Ala-Asn-Ala-Lys对人结肠癌(HT-29)细胞株具有抗癌活性[27]。豆类的蛋白质水解物可以作为抗癌剂，是治疗癌症的有效来源[6]。León-Espinosa等[28]通过对蚕豆进行水解，发现水解豆蛋白(蚕豆)对结直肠癌患者具有降血糖和抗癌作用。

3.4 降血压

血管紧张素转化酶(ACE)可催化非活性血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，是一种有效的血管收缩剂。蛋白质水解产生的生物活性肽可通过抑制ACE活性，使血压降低。ACE的天然抑制剂通常由短序列氨基酸组成，比合成药物更能保证降低血压，而且没有任何长期的副作用。多肽的氨基酸组成和分子质量决定其活性。研究表明，芝麻蛋白消化液(SPDS)经不同分子质量截留(MWCO)膜超滤纯化，SPDS-Ⅶ(<3 kDa)对ACE抑制作用最强[29]。肉类或牛奶蛋白水解产生的多肽是有活性的ACE抑制剂的来源[14]。Yang等[30]研究发现，长期服用大豆水解蛋白可以通过抑制ACE的作用，延缓自然高血压小鼠的血压升高。Roslan等[31]酶解罗非鱼蛋白质后发现其ACE抑制活性高达88.26%，具有较强的降血压功能。

3.5 免疫调节

生物活性肽具有免疫活性，可以提高动物的免疫能力。少于20个氨基酸残基、富含精氨酸、赖氨酸和脯氨酸残基的肽段具有诱导免疫调节和抗菌等有益作用[32]。沈一茹等[33]以肉鸡为研究对象，探究大豆酶解蛋白对其生长性能及免疫器官发育的影响，饲喂42 d后发现肉鸡料重比显著降低，生长性能与免疫能力均有所提高。吴远彩等[34]研究发现，在饲料中添加1%～2%的小肽可提高凡纳滨对虾幼虾血清中非特异性免疫酶酚氧化酶(PO)和酸性磷酸酶(ACP)的活性，有利于增强其非特异性免疫力和抗病力。Ashaolu等[35]的一项研究发现，大豆蛋白的胃蛋白酶酶解产物可改善大鼠的免疫系统，其作用机制是刺激脾细胞增殖并表现出吞噬活性；用大豆蛋白水解液喂养大鼠后，血清免疫球蛋白G、免疫球蛋白A含量明显升高。

4 蛋白质水解物的制备

4.1 化学法

蛋白质水解的化学处理包括使用酸或碱来裂解肽键。水解植物性蛋白质一般是用无机酸(通常为4～6 mol/L盐酸)在100～130 ℃下处理4～24 h，然后用氢氧化钠中和得到[36]。碱水解法一般采用强碱(如4 mol/L氢氧化钠或氢氧化钾等碱水解剂)在105 ℃高温下反应20 h将蛋白质完全水解[37]。碱水解法在食品和饲料应用中不太常见，因为在碱性条件下的热处理会产生有毒物质，导致L-氨基酸外消旋转为不能利用的D-氨基酸，并会破坏部分氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸等[38]。尽管酸水解法比碱水解法更受欢迎，但酸水解过程会破坏色氨酸和半胱氨酸的结构，将谷氨酰胺和天冬酰胺分别转化为谷氨酸和天冬氨酸[39]。此外，酸水解法和碱水解法都不存在专一性，不能有选择性地水解某些氨基酸肽键，中和过程会在最终产品中产生大量的盐。一般来说，基于化学水解的工艺产生的蛋白质水解物营养价值降低，功能性差，仅限于用作风味增强剂[40]。

4.2 酶解法

酶解法是蛋白质水解制备生物活性肽非常有效的方法[41]。酶解法选用的酶包括碱性蛋白酶、风味酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等，一般来源于微生物、动物或植物。微生物来源的酶比其他来源的酶具有更高的耐热性、高pH和适当的蛋白质水解特性。碱性蛋白酶被发现是鱼蛋白水解的一种高效酶，因为它能够在温和的条件下在相对较短的时间内达到高度的水解，并能产生具有良好营养和功能性质的鱼蛋白水解物[42]。水解蛋白质可以采用单一酶完成，也可以采用多种酶复合完成。酶的选择取决于蛋白质的种类和需要的水解程度。例如，水解含有较多疏水性氨基酸的蛋白质，需优先选择可裂解氨基酸肽键的酶[14]。酶解是利用酶作用于底物在适当的条件下进行的过程，酶的种类、pH、时间、温度、酶底物比、固液比和加酶量的不同，所得产物的生物活性也有所不同。酶解是一种特殊的工艺，易于控制水解程度，水解条件温和，可最大程度减少蛋白质底物的营养损失，保留原蛋白质的营养价值。

4.3 微生物发酵法

微生物发酵法是利用微生物在适宜条件下产生的蛋白酶将蛋白质水解为多肽和游离氨基酸的方法。通过微生物的代谢和发酵活动可以产生具有不同氨基酸序列和分子质量的各种活性多肽，也是生产生物活性肽的重要方式。微生物发酵酶解常选用的菌株包括细菌、霉菌和酵母等，如枯草芽孢杆菌、米曲霉、乳酸杆菌和酵母菌[43]。不同的菌株对蛋白质原料的作用是不同的，枯草芽孢杆菌对豆类蛋白水解效果较好，乳制品的生产常选用乳杆菌或乳球菌。微生物发酵受多个因素的影响，主要包括微生物菌株类型、蛋白质来源、发酵时间和温度等[44]。微生物发酵不仅可以分解蛋白质为多肽和游离氨基酸，它还可以除去蛋白质原料中的超过敏和抗营养因子。微生物发酵过程中产生的酶能分解蛋白质原料中的脂肪和鱼腥味物质，使产品具有更好的感官品质或独特的发酵香气[45]。另外，微生物发酵酶解还会产生一些有抗菌活性的肽段，可以降低疾病的发病率；产生的芳香物质对提高食物的适口性也有重要作用。王文娟等[46]采用微生物发酵技术酶解豆粕原料，最终制得的大豆肽具有很好的风味和生理特性。

5 蛋白质水解物在宠物食品中的应用

5.1 促进养分消化吸收

蛋白质、氨基酸等营养物质是宠物食品不可缺少的重要组成成分，营养物质的消化吸收直接影响着宠物的生长发育。原料蛋白质水解后相当于预消化，可大大提高宠物对蛋白质和氨基酸的消化率，促进宠物的生长。Martínez-Alvarez[47]研究发现，通过蛋白质水解获得的特定的类激素肽可以调节动物胃肠道运动、内分泌和养分的摄入，并对其生长性能产生积极影响。Tjernsbekk等[48]用酶解的三文鱼蛋白水解物制备宠物膨化食品，发现其粗蛋白质和氨基酸的表观总消化率显著提高。Pinto等[49]将水解鸡肝粉(HCLP)加入到成年犬饲粮中，结果发现HCLP由于某些必需氨基酸和脂肪酸的含量较高，可满足成年犬的营养需求，并且添加258 g/kg HCLP可提高犬对饲粮的接受性和消化率。

5.2 降低过敏性

食物中的蛋白质是引起宠物过敏反应的主要原因之一，蛋白质的类型以及含量均影响宠物的过敏性。例如，谷蛋白会导致宠物患谷蛋白敏感肠病，高浓度的蛋白质不仅容易引起宠物的过敏反应，还容易形成生物胺，产生毒性作用，给宠物健康带来危害[50]。蛋白质通过水解会将大的多肽链分解成较小的多肽和氨基酸，降低分子质量，从而降低原始蛋白质的抗原性，减少过敏反应。一般蛋白质水解物的平均分子质量分布在800～1 500 Da，不具有致敏性[1]。Olivry等[51]在宠物(如犬和猫)饲粮中添加家禽副产品的水解物，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和血清学试验发现其具有抗过敏作用，可大大减少宠物的过敏问题。Weemhoff等[52]和Noli等[53]研究发现，水解蛋白质饮食可以通过降低食物成分的过敏性，有效诊断和治疗犬和猫的食物不良反应。

5.3 提高适口性

食物的适口性是影响宠物采食量的重要因素。研究发现，蛋白质经过水解后产生的短肽和游离氨基酸，可以改善食物的适口性。蛋白质水解物由于含有较高浓度的短肽和游离氨基酸，是商业猫粮中最受欢迎的适口性增强剂之一。Folador等[54]报道了鲑鱼蛋白水解物(SPH)有较高的氨基酸消化率，当提供给犬时，发现含有SPH的膨化犬粮具有很好的适口性。Nchienzia等[55]研究发现，低灰分家禽粉用商业蛋白酶Alcalase、Flavourzyme、Protamex和Liquipanol处理后，其水解物对提升宠物食品的口感很重要，其中相对便宜的水解家禽粉可用于改善宠物食品的风味。陈晓[56]利用胰酶水解鸡肝蛋白，发现结合美拉德反应制备的犬粮诱食剂，可大大提高犬粮的适口性。郭艳霞[57]发现，利用动物水解专用酶和木瓜蛋白酶水解鸡肉与酶解前相比，可以改善犬粮风味特性，提高犬采食量。

5.4 促进矿物元素吸收

矿物元素是宠物生长发育非常重要的营养素，宠物缺钙会导致幼犬患佝偻病、成犬患软骨病、老年犬患骨质疏松，还会导致犬出现食欲不振、精神萎靡和异食癖等症状。研究发现，蛋白质水解后得到的小肽可以作为Ca2+跨膜运输的载体，与Ca2+螯合后生成肽螯合钙，其吸收效率高，是良好的宠物钙补充剂来源[58]。郭丽丽等[59]在对矿物元素吸收肽的研究过程中发现，当水解液pH为8.0、水解100 min、45 ℃温度条件下，利用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制备的肽体外持钙活性最强，具有良好促进钙吸收的能力。

5.5 抗氧化作用

宠物通过正常的细胞活动和各种应激会源源不断产生自由基。这些自由基可以摧毁宠物的防御系统，导致疾病，并可能加重遗传易感性疾病，如犬髋关节发育不良(CHD)、慢性阻塞性肺疾病或关节炎。因此，在饮食中加入抗氧化剂可以通过灭活有害的自由基来对宠物健康发挥重要作用[60]。生物活性蛋白水解物是天然的、更安全的抗氧化剂的潜在来源。大量研究表明，米糠蛋白、牛奶酪蛋白、大豆蛋白、高粱蛋白和玉米蛋白所产生的水解物或生物活性肽在体外和体内均显示出较高的抗氧化活性。宠物食品是含脂肪的产品，脂质含量可以从5%～40%[61]。防止脂质氧化对于宠物的健康以及保持宠物食品的质量是很必要的。Hu等[62]对酒糟水溶性干谷物蛋白进行酶解，发现其水解物可减少宠物食品的脂质氧化过程，大大延长了宠物食品的保质期。Wang等[63]研究表明，火鸡肉在最佳水解条件下(50.1 ℃、1.1 h、pH 5.4)通过风味酶水解，该蛋白质水解物可作为天然抗氧化剂的潜在来源，在宠物功能性食品中的应用有重要意义。蛋白质水解物作为宠物食品的天然抗氧化剂，不仅可以抑制宠物食品的脂质氧化，还可能改善宠物的健康。

5.6 保健功能

蛋白质水解物是很有前途的保健品，其具有一系列潜在的生物活性，包括抗氧化、抗高血压、免疫调节等，对宠物疾病的治疗有重要作用。Zóia Miltenburg等[64]在挤压饲粮中添加酶解禽副产物粕(HPM)，发现其可抑制猫血清ACE活性，在不影响消化率的情况下促进其形成良好的粪便稠度。蛋白质水解物饮食可以作为宠物炎症性肠病(IBD)药物治疗的有效辅助手段，在6只患有顽固性IBD的犬中，有4只单独使用大豆水解物饮食治疗后临床症状缓解，组织病理学改善[65]。蛋白质水解物饮食由于可以促进养分消化和降低食物抗原性，有助于治疗胰腺外分泌功能不全(EPI)。Biourge等[66]将以大豆和鸡肉为基础的蛋白质水解物饲喂给3只患有EPI的德国牧羊犬，结果发现在开始喂养的3周内，3只犬的粪便质量、皮肤病体征和体重都有所改善。超重和肥胖被认为是猫日益严重的问题，这会对健康产生重要的影响。通过肠道屏障的转运研究，Theysgeur等[67]从罗非鱼副产物水解物中鉴定出了能够刺激胆囊收缩素(CCK)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌并抑制二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)活性的新型生物活性肽，证明了罗非鱼副产品水解物似乎有希望预防和管理超重肥胖问题。

6 小结与展望

蛋白质饲料通过化学、酶或微生物水解后可以产生易消化吸收的寡肽、生物活性肽和特定氨基酸，对保证宠物的营养、维护宠物健康起着重要的作用。目前，蛋白质水解物广泛应用于宠物食品工业的食品配方中，以确保产品低过敏性、高消化性和高适口性，是商业犬粮、猫粮中最受欢迎的蛋白质饲料原料之一。蛋白质水解物由于其具有抗氧化、抗菌、免疫调节、抗癌等特性，也是很有前途的宠物保健品，对宠物食品中功能性产品的开发有重要意义。尽管人们对蛋白质水解物生物学效应的了解越来越多，但对其肽链分子结构的认识还较少，应增加特定功能肽段的具体结构特点的研究。此外，要了解含有蛋白质水解物的饮食对宠物生长和健康的影响，有必要更广泛、更深入地了解蛋白质水解物中生物活性肽的产生机制及提纯鉴定方法，并进行活体评估。总之，蛋白质水解物在宠物食品中有很好的应用前景，既可以作为必需氨基酸或氮的来源，也可以作为具有生物活性潜力的成分的来源。相信在不久的未来，蛋白质水解物可以在宠物行业发挥重要的价值。