自动膜芯片法检测植物蛋白饮料源性成分

李羽翡

（甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030）

植物蛋白饮品的开发丰富了我国乳制品市场，其因含丰富的蛋白质、氨基酸而受到广大消费者喜爱[1-2]。随着食品原料价格的上涨，部分生产企业为了降低生产成本，利用廉价植物原料替代或掺入原产品中，以次充好，例如央视在2018年“3·15”晚会中曝光了多家企业生产核桃露时使用成本较低的其他坚果酱或香精香料代替核桃浓浆。类似行为扰乱了正常的食品加工市场，严重危害了广大消费者的利益[3-6]，且有些消费者对个别植物源性成分存在过敏现象，如果未按事实添加或标注，有可能诱发消费者发生过敏反应，后果不堪设想[7]。

目前针对植物蛋白饮料中源性成分鉴伪的鉴定主要集中于ELISA、色谱和质谱技术以及包括聚合酶链式反应PCR、实时荧光定量PCR、微滴数字PCR、凝胶电泳、基因组文库、DNA条形码等在内的诸多分子生物学技术[8-16]。膜芯片检测技术将探针固定在膜表面，利用PCR产物进行杂交形成可视化的斑点，因此具有快速、简便、高通量、高效率等特点，被越来越多的应用于分子生物学领域。本文采用全自动膜芯片方法，可对9种植物源性成分进行同时检测，完成了兰州地区市售24份标识含有胡桃（核桃）、花生、杏仁、榛子、大豆、胡萝卜等源性成分的核桃露乳、杏仁露、胡萝卜汁等植物蛋白饮料的源性成分检测。甘肃省蛋白饮料源性成分鉴定还处于初级阶段，本研究针对兰州地区市售植物源性饮料进行摸底调查，以期为监管部门的日常监管工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品为市售核桃露、杏仁露、胡萝卜汁等植物饮品，覆盖兰州市70%以上的植物蛋白饮品。采用随机取样方法，采集样品共计26份，每份2瓶，样品包装完好，样品信息如表1所示。

表1 采样明细表

试剂：Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0）（Ta KaRa）、DNeasy mericon Food Kit（QIAGEN）、50 ml锥形离心管（Axygen）、TE缓冲溶液（Tris-EDTA buffer solutionshangbao上海爱必信）。

1.2 仪器与设备

仪器与设备：PCR仪（S 1000TM）（Bio-rad伯乐）；Nano DropTMOne/One C超微量紫外-可见光分光光度计（Thermo Scientific）；Megafuge 8/8R离心机（Thermo Scientific）；MFS-8系列膜芯片杂交仪器（四川华汉）；台式高速冷冻离心机（湖南湘仪H 2500 R）。

1.3 探针引物

本实验引物探针来源如下：腰果引物探针来源于腰果AnaO3致敏蛋白基因，杏仁来源于杏仁Pru dul基因，大豆来源于大豆lectin基因，开心果来源于开心果18SrRNA与5.8SrRNA基因间区，胡萝卜来源于胡萝卜抗冻蛋白基因，榛子来源于oleosin基因，芝麻来源于管家基因2S albumin mRNA，胡桃来源于过敏原蛋白Jug r2基因，内参及探针来源于真核生物18SrRNA基因。采用商品化食源性植物过敏原膜芯片检测试剂盒（配套仪器-华汉MFS-8系列仪器）。

2 分析方法

2.1 DNA提取与扩增

取40 ml饮料样品装入Axygen 50 ml锥形离心管，用高速冷冻离心机13000 rpm离心20 min。使用凯杰深加工食品核酸提取试剂盒提取基因组DNA，用NanoDrop紫外分光光度计测定核酸浓度，DNA的吸光值A260/A280比值介于1.8～2.0才可保证多重PCR反应的扩增效率。

2.2 多重PCR扩增程序

使用华汉MFS-8仪器配套食源性植物过敏原膜芯片检测试剂盒，反应条件：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，68℃15 s（30个循环）；68℃15 s；4℃保温；总体系为20 μl。

2.3 膜芯片杂交显色

将2.2阶段多重PCR产物95℃变性5 min，置于冰上备用。

按照植物过敏原膜芯片检测试剂盒的操作步骤，配套华汉MFS-8膜芯片杂交仪器，使用商品化的膜芯片进行去活化、清洗、杂交、孵育、洗膜和显色操作。

2.4 结果判定

将含有核桃、花生、杏仁、胡萝卜、芝麻、榛子、大豆、腰果、开心果源性成分的物种样品进行基因提取和扩增，通过2.1—2.3的操作步骤杂交显色，进行特异性评估；使用TE缓冲液将上述9份含有源性成分的标准样品DNA分别稀释至10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng 4个稀释度测定膜芯片的灵敏度。将市售核桃露（乳）、杏仁露、果仁露、胡萝卜汁等植物蛋白饮料同样按2.1—2.3的步骤操作，分别进行杂交显色，实验完成后，膜芯片上内参点和阳性对照PC点显色，阴性对照NC点不显色，代表结果有效。对照说明书中食源性植物过敏原膜芯片点阵图进行判读，探针分布模式如图1所示。

图1 探针分布模式图

3 实验结果

3.1 特异性验证

对含有以下9种（核桃、芝麻、花生、杏仁、腰果、榛子、大豆、胡萝卜、开心果）植物源性成分的物种样品进行DNA的提取、扩增，以无菌水为空白对照，通过PCR扩增，取扩增产物加样到膜芯片杂交显色试剂盒中，仪器操作杂交显色。结果显示，9种样品DNA只与其相对应的特异性源性基因发生显色反应，均被准确识别，并且杂交点清晰可见，无漏检、错检、多检现象（图2）。说明该芯片方法特异性识别能力强，可用于9种源性成分的检测鉴定。

图2 9种植物基因膜芯片杂交结果

3.2 饮料样品膜芯片杂交结果

图3 为部分饮料的膜芯片杂交结果图，涵盖了样品源性成分检测的不同结果状态。1号芯片检出大豆源性成分；2号芯片既检出花生源性成分，又检出榛子源性成分；3号、4号芯片分别检出核桃和杏仁源性成分；5号芯片检出胡萝卜成分；6芯片检出花生和大豆源性成分；7号芯片仅检出花生成分；8芯片既检出杏仁，又检出大豆成分；9号、10号未检出源性成分；11号、12号是空白对照。样品检测结果如表2所示。

表2 样品检测结果统计

图3 典型样品膜芯片杂交结果

4 结论与讨论

我国进出口行业颁布了9种植物过敏原成分检测标准，但每一个单一指标就需要一项操作标准，在实际应用中不宜推广[17-25]。国家总局颁布的补充检验方法BJS 201707虽涵盖4种植物源性成分指标，但仍是单重实时荧光PCR检测，1次扩增只能判读1个数据指标，对于大规模的数据筛查十分不利[26]。本试验采用商品化全自动膜芯片检测方法，该方法具备检测速度快、上样通量大、灵敏度高等特点，适用于9种植物过敏原性成分的同时检测[7，27-31]。

结果显示，兰州市售24份植物饮料中，有2份胡萝卜汁未检出植物源性成分，不合格率为7.7%，说明市售饮料中存在原料不实、以次充好的现象。因此，相关监督管理部门应因地制宜，针对不同产品的特点和问题隐患开展监管工作。其余几种坚果类植物蛋白饮料未发现标签不实或缺失源性成分的现象，说明本领域内生产企业可以做到规范生产、诚信经营。此外，本次筛查工作只对源性成分进行了检测，无法确定在标签标识之外是否添加了其他成分，这方面的工作还需要参考理化相关分析数据。因此，植物源性饮料的检测工作任重道远，还需要进一步深入研究。