动脉栓塞用直链烷基修饰的氧化石墨烯对免疫细胞的影响

曾琳源， 王立翔， 张桂元， 唐可禺， 林 润， 陈 斌， 戴海涛， 杨建勇， 黄勇慧

纳米技术的进步和肿瘤免疫治疗在临床的成功，提示两个学科的融合必将为改善肿瘤治疗产生巨大的动力。石墨烯及其衍生物，例如直链烷基修饰氧化石墨烯(linear alkyl grafted graphene oxide，GO-C18)纳米载体的二维结构使其具有极高的比表面积和卓越的载药性能[1-2]。本课题组已在前期工作中初步证明阿霉素(doxorubicin，DOX)负载的GO-C18经导管动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)治疗肝癌是安全有效的[3-4]。然而，肝癌肿瘤免疫环境复杂，各种治疗方式引起的机体免疫细胞状态改变对疗效影响亦十分重要。治疗对免疫系统的刺激有抗肿瘤效应，亦有促肿瘤生长效应[5-6]。研究报道纳米药物载体对机体免疫系统、免疫细胞具有一定的影响[7-8]。GO-C18对机体免疫细胞造成影响尚不确定，有必要明确其对机体免疫细胞的作用，探索GO-C18作为药物载体治疗肝癌时对免疫识别肿瘤抗原、杀伤肿瘤细胞的作用。本研究将不同浓度氧化石墨烯(graphene oxide,GO)、GO-C18干预体外细胞，利用免疫细胞表面特异性生物标志物，通过流式细胞仪检测巨噬细胞抗原呈递、吞噬功能和M1表型及活化，以及T细胞、B细胞的活化。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 实验动物BALB/c小鼠，18～22 g，购自广东省实验动物中心(动物实验伦理批号SYSU-IACUC-2019-000106)，L1210细胞株(广州吉妮欧生物科技有限公司)，胎牛血清(北京TransGen Biotech公司)，RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；青霉素/链霉素抗生素(美国Gibco公司)，CytoFLEX流式细胞仪(美国Beckman公司)。CD3 APC-A700、CD8 PC7(美国Beckman公司)，CD69 PE、CD4 FITC、CD80 FITC、CD86 PB450、信号调节蛋白α(signal regulatory protein alpha,SIRPα) APC、主要组组织相容性复合物Ⅱ(major group histocompatibility complex Ⅱ,MHCⅡ) APC(美国BD公司)等抗体用于流式细胞分析和细胞分选。GO、GO-C18由本课题组按照前期方法制备[1]。材料均辐照灭菌。

1.2细胞培养及共培养体系构建 巨噬细胞、T细胞、B细胞及L1210细胞均于含1%青霉素/链霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行常规培养。所有细胞取对数期细胞进行实验。小鼠巨噬细胞-白血病细胞共培养体系建立方法：将处于对数期巨噬细胞和L1210细胞制成细胞悬液，巨噬细胞以6×105/孔铺于0.4 μm孔径的Transwell小室中，L1210细胞以3×105/孔铺于Transwell小室下面6孔板的底部，加入适量完全培养基。待接种24 h细胞贴壁后将上培养室移回种有L1210细胞的Transwell培养板进行共培养，构建共培养体系并分组实验。

1.3巨噬细胞提取培养及功能检测

1.3.1 巨噬细胞提取 取6～8周BALB/c小鼠，采用颈部脱臼法处死，解剖取出股骨和胫骨，剔除干净肌肉组织后在75%酒精内浸泡5 min，随后于超净工作台内剪去两端骨骺暴露出骨髓腔，用1 ml注射器吸取无菌生理盐水，将针头插入骨髓腔内冲洗出骨髓细胞，反复冲洗3次。收集冲洗液于干净细胞皿内，经1 500 r/min离心5 min后吸去上清，加入红细胞裂解液静置5 min后用等量生理盐水终止反应，1 500 r/min离心5 min后取细胞沉淀，将所得骨髓细胞种于细胞皿内，同时加入50 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)诱导巨噬细胞分化，经过7 d后，成功诱导出巨噬细胞进行常规培养。

1.3.2 巨噬细胞吞噬能力检测 成功诱导巨噬细胞后，设置GO、GO-C18两个实验组，使用药物浓度相同；对照组以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)进行处理。以200 μg/ml、100 μg/ml、50 μg/ml浓度的GO、GO-C18和等量的PBS分别处理巨噬细胞24 h和48 h，显微镜下观察细胞状态，并通过抗CD47、IgG抗体检测各组巨噬细胞的吞噬能力[9]。然后，使用10 μg/ml GO、GO-C18同法处理巨噬细胞12 h和24 h，并观察细胞状态，检测其吞噬能力。建立巨噬细胞-L1210细胞共培养体系，以10 μg/ml GO、GO-C18处理巨噬细胞12 h和24 h后，检测巨噬细胞对L1210肿瘤细胞的吞噬能力，同法观察细胞状态并检测其吞噬能力[10-11]。

1.3.3 巨噬细胞活化及其他功能检测 以10 μg/ml GO、10 μg/ml GO-C18和等量的PBS分别处理巨噬细胞24 h和48 h后，加入抗CD69、CD80、CD86、SIRPα、MHCⅡ抗体行流式分析，检测巨噬细胞表面CD69、CD80、CD86、SIRPα、MHCⅡ等标志物的表达情况[12-14]。

1.4其他免疫细胞的活化检测 取BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞在体外培养，利用抗CD3、CD4、CD8抗体流式分选CD4+T、CD8+T、B细胞，同样设置PBS、GO、GO-C18三组进行实验。以10 μg/ml GO、10 μg/ml GO-C18和等量的PBS处理CD4+T、CD8+T细胞、B细胞48 h、60 h和72 h后，加入抗CD69抗体行流式分析，检测CD69表达情况[12，15]。

2 结果

2.1巨噬细胞的吞噬功能 首先检测200 μg/ml和100 μg/ml两个浓度的GO、GO-C18分别处理24 h和48 h后对巨噬细胞吞噬能力的影响，发现其对巨噬细胞有明显的细胞毒性，细胞死亡。于是，用50 μg/ml的处理浓度分别检测这两个纳米材料对巨噬细胞吞噬能力的影响，结果发现处理24 h和48 h后，其对巨噬细胞仍有明显的细胞毒性，细胞死亡。最后，用10 μg/ml的纳米材料处理12 h和24 h后，巨噬细胞正常生长，并可吞噬GO颗粒，于是检测了10 μg/ml的纳米材料处理巨噬细胞后，巨噬细胞对L1210肿瘤细胞吞噬能力未受到明显影响(P>0.05)。见图1～2。

图1 10 μg/ml的GO和GO-C18分别处理巨噬细胞12 h后吞噬能力图

图2 10 μg/ml的GO和GO-C18分别处理巨噬细胞24 h后吞噬能力图

2.2巨噬细胞活化与其他功能 通过流式分析检测10 μg/ml的GO、GO-C18分别处理24 h和48 h后巨噬细胞表面标志物的表达变化，从而判断其对于巨噬细胞的活化(CD69)、M1表型(CD80、CD86)、M2表型(SIRPα)、抗原提呈能力(MHCⅡ)的影响。结果表明，10 μg/ml的GO、GO-C18分别处理24 h和48 h后，其对于巨噬细胞的活化、M1表型、M2表型、抗原提呈能力均无明显的影响(P>0.05)。见图3～4。

图3 10 μg/ml的GO和GO-C18分别处理巨噬细胞24 h后标志物表达情况图

图4 10 μg/ml的GO和GO-C18分别处理巨噬细胞48 h后标志物表达情况图

2.3其他免疫细胞的活化 用10 μg/ml的GO、GO-C18分别处理48 h、60 h和72 h后，检测其对于脾脏中的免疫细胞的影响。通过流式细胞技术检测脾脏中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞中CD69的表达情况。结果表明，10 μg/ml的GO、GO-C18分别处理48 h、60 h和72 h后，GO、GO-C18组CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞活化较PBS均没有产生明显的影响(P>0.05)。见图5～8。

图5 10 μg/ml的GO和GO-C18分别处理T细胞48 h后活化状态图

图6 10 μg/ml的GO和GO-C18分别处理T细胞60 h后活化状态图

图7 10 μg/ml的GO和GO-C18分别处理T细胞72 h后活化状态图

图8 10 μg/ml的GO和GO-C18分别处理B细胞48 h、60 h、72 h后活化状态图

3 讨论

3.1介入医学的发展与新材料的发展密切相关，目前“医工”结合使得更多的新型材料逐渐应用于介入领域[16]。GO作为一种新型、潜在的栓塞介入材料，已经逐渐得到介入领域的重视。本课题组前期设计制备的阿霉素负载的直链烷基修饰氧化石墨烯(doxorubicin loaded linear alkyl grafted graphene oxide，DOX@GO-C18)能安全且有效地用于肝癌的TACE治疗[3，17]。兔VX2肝癌实验动物模型接受TACE治疗2周后，CT增强扫描显示肿瘤血供显著减少；病理检查显示肿瘤明显坏死，且术前及术后2周肝功能损伤是有限且可逆的，无严重并发症。

3.2纳米技术可以改善药物对特定组织、细胞和亚细胞区室的靶向递送，确保药物持续稳定和释放，减少剂量限制性毒性，并减轻肿瘤免疫微环境施加的不利影响。研究报道纳米药物或载体对肿瘤免疫微环境具有一定调节作用，主要表现在增强肿瘤免疫原性、活化抗原呈递细胞、T细胞及自然杀伤细胞、调节肿瘤相关巨噬细胞、抑制甚至消除髓系来源的抑制细胞等[18-19]。有研究表明，部分纳米材料，例如纳米羟基磷灰石具有免疫调节潜力，使T细胞和M1巨噬细胞标志物的表达升高促进M2巨噬细胞极化、组织血管化[20]。聚乙二醇纳米载体可以诱发体内产生抗体，激活补体，某些补体激活途径还促进抗炎M2表型巨噬细胞，从而进一步促进肿瘤生长[21]。因此，研究纳米载体本身对于免疫细胞，甚至免疫系统的影响是非常重要的。本研究初步探索了GO-C18作为载体对主要免疫细胞，包括巨噬细胞、T细胞、B细胞功能状态的影响。结果显示GO-C18及GO在10 μg/ml的浓度下对机体巨噬细胞活化、发挥吞噬功能、抗原呈递无抑制作用，对T细胞、B细胞的活化亦无明显影响。因此，在体外的细胞实验中，可以看到GO-C18作为载体，并没有对免疫细胞产生正向或者负向的影响，本身无免疫原性。其具备了通过加载药物，改造成为免疫增强或者免疫抑制纳米载体的潜力。目前应用于临床的栓塞材料，比如明胶海绵、栓塞微球等，其本身也无免疫原性。

3.3本研究的局限性主要是：(1)没有在体内进行GO-C18对免疫细胞影响的研究。栓塞用的GO-C18对体内免疫细胞和肿瘤免疫微环境的影响有待进一步在体内实验中验证。(2)本研究仅对部分主要免疫细胞进行检测，没有纳入所有的免疫细胞进行检测。(3)本研究对免疫细胞观察的时间有限，无法获得GO-C18对免疫细胞的长期影响。

综上所述，动脉栓塞用GO-C18对巨噬细胞功能与活化以及T细胞、B细胞的活化无显著不良影响，可以作为一种潜在的纳米载体，为肝癌的介入治疗提供新的栓塞材料选择。