半滑舌鳎细胞分裂周期蛋白42 基因克隆与结构预测

刘厚孚，谭静，胡秀彩，管振国，吕爱军，通信作者，孙敬锋

（1.天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392；2.天津鼎正新兴生物技术有限公司，天津 300383）

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国主要的海水经济鱼类之一[1]，具有活动范围小，个体大、生长快、营养等级低、食性温和等性状优点。近年来，随着养殖规模日益扩大，半滑舌鳎皮肤溃烂病、腹水症等病害问题也随之而来，对水产养殖行业造成了一定的经济损失。目前，对于半滑舌鳎天然免疫和细胞分子免疫机制知之甚少[2-3]。

细胞分裂周期蛋白42（Cell division cycle 42，Cdc42）属于小Rho GTPase 家族，与GTP 结合时处于活化状态，与GDP 结合时处于失活状态，是一种具有酶活性的Rho GTP 酶[4-5]。研究发现，Cdc42 参与多种细胞功能，包括调节细胞骨架、控制细胞极性等[6-7]。迄今，对人和哺乳动物研究表明，Cdc42基因与疾病和机体免疫应答密切相关，包括癌症、艾滋病等多种疾病发生，且参与免疫与炎症反应[8-9]。BURBAGE 等研究发现Cdc42是B 细胞分化的关键调控因子，是抗病毒体液免疫所必需的因子[10]；HADDAD 报道Cdc42与WASP之间相互作用引导SDF-1 诱导T 淋巴细胞趋化[11]；WESTERBERG 等研究表明，Cdc42、Rac1 和Wiskott-Aldrich 综合征蛋白参与B 淋巴细胞的细胞骨架调节[12]；王缘等[13]在小鼠巨噬细胞中特异性敲除Cdc42基因，并使用LBS 诱导炎症反应，结果发现小鼠死亡率增高，证实Cdc42在免疫调节中发挥了重要作用。

在水产动物中，针对Cdc42基因克隆及表达分析的研究鲜有报道[5,14]。关于半滑舌鳎Cdc42的功能研究尚未见相关文献报道。因此，本研究以半滑舌鳎为研究对象，对其皮肤细胞分裂周期蛋白42 基因进行克隆，并对其基因编码序列进行蛋白结构预测分析，为今后深入研究Cdc42基因功能提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）取自天津市海发珍品实业发展有限公司，体重平均（110±10）g，取其皮肤组织立即投入液氮冷冻，后转入-80 ℃冰箱保存，用于总RNA 提取。RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR Master Mix、PCR Buffer 体系购自TaKaRa 公司，DNA Marker、UNIQ-10 柱式胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

根据半滑舌鳎Cdc42基因编码序列（登录号：XM_008320479.3），用生物软件Primer5.0 设计1对特异性引物（表1），引物由苏州金唯智生物有限公司合成。

表1 Cdc42 的特异性引物

1.2.2 总RNA 提取和cDNA 合成

参照HUSAIN 等[15]的提取方法，使用TRIzol Reagent 试剂提取半滑舌鳎皮肤组织的总RNA，并分别加入氯仿、异丙醇和乙醇，离心、震荡、弃去上清液等。使用超微量分光光度计测量提取的总RNA 浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。以提取的总RNA 为模板，用TaKaRa 的反转录试剂盒（PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成cDNA。合成的cDNA 保存于-20 ℃备用。

1.2.3CsCdc42基因克隆

参照舒欢欢等[16]的克隆步骤进行试验，用25µL 体系扩增半滑舌鳎皮肤的Cdc42基因。反应体系具体为：Cdc42基因DNA 模板2 µL，上下游引物各1 µL，无菌超纯水11 µL，2×Taq PCR Mix 10µL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，30 个循环；72℃延伸5 min。使用1%琼脂糖PCR 检测，切胶回收，并与pMD18-T 载体连接、转化到感受态大肠杆菌DH5α 后，挑选阳性单克隆菌液送到天津金唯智生物工程有限公司测序。

1.2.4CsCdc42基因序列与结构预测

参照谭静等[17]的文献进行。采用ORF 程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找序列的开放阅读框，利用在线分析软件EXPASY、PHYRE2、SMART 和PSIPRED 进行生物信息分析及结构预测，用DNAStar 软件进行基因蛋白抗原性、亲水性等理化特性分析，用ClustalW 及MEGA 7.0 进行序列比对及构建系统进化树分析。

2 结果

2.1 半滑舌鳎CsCdc42 基因克隆

以半滑舌鳎皮肤组织cDNA 为模板，采用RT-PCR 方法扩增Cdc42基因得到目的条带，并与预期片段大小一致（图1）。切胶回收、将其亚克隆至pMD18T 载体，转化大肠杆菌DH5α 后、挑选pMD18T-Cdc42 阳性克隆基因测序，测序获得半滑舌鳎Cdc42目的基因序列及其引物（图2），命名为CsCdc42。

图1 半滑舌鳎CsCdc42 基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳

图2 半滑舌鳎CsCdc42基因的引物序列

2.2 半滑舌鳎 Cdc42 cDNA 编码蛋白的序列特征及生物信息学分析

半滑舌鳎 CsCdc442 基因测序获得目的基因序列的片段长度为847 bp，推测编码191 个氨基酸（图3）。预测理论等电点（PI）为6.73，分子量为21.26 kD。通过生物信息学方法预测表明，Cdc42基因没有信号肽，推测 Cddc42 可能不是分泌蛋白。对半滑舌鳎CDc42蛋白跨膜区分析表明，该蛋白无跨膜区，说明该蛋白为非跨膜蛋白。亲疏水性分析结果显示疏水性最小值约为-3.01，最大值约为3.00，，整个多肽链中为负值的氨基酸占多数，推测CsCdc42 为亲水性蛋白（图4），蛋白平均系数GRAVY 为-0.195。

图3 半滑舌鳎CsCdC42 cDNA编码区序列及其推导的氨基酸序列

图4 半滑舌鳎CsCdc42 亲疏水性分析

预测CsCdc42 含有7 个主要抗原表位（27-28、61-63、90-92、120-122、131-133、164-166、181-183 aa），说明该基因蛋白抗原性良好（图5）。

图5 半滑舌鳎CsCdc42 蛋白表面和抗原指数分析

进一步对CsCdc42 蛋白修饰位点预测发现CsCdc42 没有糖基化位点，有多个磷酸化位点，当阈值≥0.5 时共有17 个磷酸化位点，其中8 个丝氨酸（Ser）磷酸化位点（S22/30/70/82/84/89/90/126），6 个苏氨酸（Thr）磷酸化位点（T2/24/25/109/117/161），3 个酪氨酸（Tyr）磷酸化位点（Y30/64/157）。此外，阈值≤0.5 时，丝氨酸磷酸化位点主要分布在80-90 aa之间，苏氨酸磷酸化位点主要分布在20-40 aa 之间，酪氨酸磷酸化位点在20-40 aa 之间显著分布（图6）。

图6 半滑舌鳎Cdc42 基因的磷酸化位点分析

2.3 Cdc42 多序列比对与系统发育树分析

采用Blast 软件在线搜索结果显示，CsCdc42与斑马鱼（Danio rerio，NP_956926.1）的氨基酸同源性最高为99.43%，其次与人（Homo sapiens，pdb|2ODB|A）和青鳉（Oryzias melastigma，XP_024148790.1）分别为98.43%和97.91%，与虹鳟（Oncorhynchus mykiss，ACO08171.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，AWP03434.1）、果蝇（Drosophila willistoni，XP_002075304.1）、凡纳滨对虾（Penaeus vannamei，AIY53010.1）、双斑蛸（Octopus bimaculoides，XP_014784384.1）的同源性分别为95.81%、94.76%、93.19 %、91.10%、91.10%。进行CsCdc42基因氨基酸多重序列对比分析，发现在人、斑马鱼、青鳉、果蝇等模式生物以及多种水产动物中，Cdc42 蛋白序列含有RHO 结构域、ATP/GTP 结合位点、酰基化位点3个高保守区域，这可能与细胞分裂周期蛋白功能有关（图7）。从NCBI 数据库下载人、斑马鱼、大菱鲆、青鳉、虹鳟等17 个Cdc42相关基因序列，构建系统发育树分析结果显示，CsCdc42与斑马鱼（Danio rerio，NP 956926.1）、人（Homo sapiens，pdb|2ODB|A）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，KAF0035709.1）、青鳉（Oryzias latipes，XP 011475757.1）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss，XP 021472057.1）亲缘关系最近，自然聚为一支；与南美白对虾（Penaeus vannamei，AIY53010.1）、果蝇（Drosophila melanogaster，AAD43792.1）亲缘关系较近；与南极鳕（Notothenia coriiceps，XP_010773360.1）、杂色鳉（Cyprinodon variegatus，XP_015226325.1）、斗鱼（Betta splendens，XP_029023734.1）、鲫（Carassius auratus，XP_026109495.1）等亲缘关系较远，聚为另一支（图8）。

图7 不同物种Cdc42 氨基酸序列多重比对分析

2.4 半滑舌鳎Cdc42 结构预测

对半滑舌鳎Cdc42 结构预测结果表明，Cdc42只有一个RHO 结构域，氨基酸位点在6-179 aa。二级结构预测α 螺旋占30.9%、β 折叠占24.6%、无规则卷曲占44.5%，说明Cdc42 主要由α 螺旋和无规则卷曲构成（图9A）；由三级结构预测可以看出CsCdc42 是一个球形蛋白质（图9B）并且和二级结构结果基本一致，同时预测在氨基酸10-18 aa 为CsCdc42 的ATP/GTP 结合位点，在54-60 aa 为CsCdc42 的酰基化位点（图9C）。

图9 Cdc42 基因编码的蛋白结构预测

3 讨论

迄今为止，对于鱼类的Cdc42基因研究相对较少，关于半滑舌鳎Cdc42功能研究尚未见相关文献报道[5-6]。胡默俨[14]对草鱼Cdc42基因克隆表达分析，结果表明Cdc42基因编码191 个氨基酸，为不稳定性蛋白，无跨膜结构域和信号肽，并只含有一个保守结构域RHO，这与本试验半滑舌鳎CsCdc42基因序列分析结果基本一致。进一步通过Cdc42氨基酸序列构建系统发育进化树分析，结果显示半滑舌鳎CsCdc42 属于Rho 超家族酶蛋白家族，而且与斑马鱼、人、青鳉和虹鳟Cdc42亲缘关系最近。此外，预测半滑舌鳎CsCdc42含有7 个主要抗原表位（27-28、61-63、90-92、120-122、131-133、164-166、181-183 aa），说明该基因蛋白抗原性良好，其抗原保护性功能值得进一步研究。

Cdc42 是Rho 蛋白家族中研究比较深入的成员，可以调节肌动蛋白细胞骨架和各种细胞黏附，对于机体发育与繁殖有重要影响[7]。在对人类和哺乳动物的研究中发现Cdc42与许多器官以及各种疾病密切相关。LI 等[18]通过将Cdc42-flox 小鼠与肌球蛋白轻链（MLC）2a-Cre 小鼠杂交试验，确定Cdc42在心肌细胞增殖和细胞黏附中有重要作用。OLENIK 等[19]通过采用原位杂交和Western blot方法研究Rho GTPases 在成年大鼠大脑中的表达情况，在海马神经元、齿状回颗粒细胞和肺门细胞中检测到大量RhoA、RhoB、Rac1 和Cdc42 mrna，Western blot 检测到海马、小脑、丘脑和大脑皮层中含有RhoA和Cdc42蛋白，所以认为Rho GTPases在大脑细胞功能调节中发挥作用。ZAN 等人通过逆转录聚合酶链反应检测20例食管癌及癌旁正常组织中Cdc42和Rb基因表达，结果发现Cdc42基因异常表达影响了食管癌发生[20]。CHERNICHENKO等[21]通过单个细胞轨迹分析对鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）进行siRNA 筛选，认为Cdc42在癌细胞神经侵袭及治疗癌症方面有重要意义。目前，对水产动物的Cdc42基因研究发现，Cdc42可能对于水产生物防御病原体的细胞以及分子机制有重要作用。李丽丽等[5]通过对斑节对虾Cdc42基因克隆表达分析，研究斑节对虾在哈维弧菌（Vibrio harveyi）胁迫下的表达情况，结果发现Cdc42在血淋巴中的表达较高，并且在哈维弧菌胁迫情况下发现Cdc42上调显著，证明Cdc42可能具有重要免疫调节作用；胡默俨[14]在草鱼Cdc42克隆试验中，通过荧光定量PCR 技术发现Cdc42基因在头肾、中肾、肝、脾等免疫器官中均有不同程度表达，但Cdc42在水产动物中的具体免疫机制仍不清楚，值得进一步研究。

本研究采用RT-PCR 方法对半滑舌鳎皮肤Cdc42基因进行克隆，并对其编码蛋白质进行序列和结构预测分析，为今后深入研究Cdc42基因功能打下基础。关于鱼类细胞分裂周期蛋白42 基因序列特征及其蛋白功能，今后仍有待进一步试验研究证实。