清眩丸中5种挥发性成分含量测定气相色谱法的建立Δ

刘 杰，刘长河，王艳艳（河南省中医药研究院中药研究所，郑州 450004）

清眩丸为2020年版《中国药典》（一部）收载品种，是由薄荷、荆芥穗、川芎、白芷、石膏5味中药加工制成的丸剂，分为大蜜丸和小蜜丸2种规格，具有散风清热之功效，主要用于风热头晕目眩、偏正头痛、鼻塞、牙痛等症状[1]。另有研究报道，清眩丸还具有抗菌、消炎、降血压等作用[2]。目前，对清眩丸及同处方清眩片成分测定和质量控制的研究包括采用高效液相色谱法[3－5]、超高效液相色谱法[6]、液相色谱-质谱法[7]测定其中1种或多种成分的含量，采用超高效液相色谱法建立清眩丸的指纹图谱[8]，采用气相色谱法测定清眩片中薄荷脑的含量[9]等。挥发性成分是清眩丸的重要有效成分，清眩丸中的薄荷含薄荷酮、薄荷脑等成分[10]，荆芥穗含胡薄荷酮、胡椒酮等成分[11－12]，川芎含藁本内酯、丁烯基酜内酯等成分[13]。其中，薄荷酮对内毒素所致炎症模型小鼠有保护作用[14]；薄荷脑具有明显的抗肿瘤活性，对人胃癌SGC-7901细胞的增殖有抑制作用[15]；胡薄荷酮对二甲苯所致耳廓肿胀模型小鼠、角叉菜胶所致足肿胀模型大鼠和脂多糖所致急性肺损伤模型大鼠的急性炎症均有改善作用[16]；胡椒酮有平喘、止咳及抗菌作用[17]；藁本内酯可加速药物透过血脑屏障，具有抗凝、抗炎、镇痛、抗氧化、保护神经等药理活性[18－20]。2020年版《中国药典》（一部）清眩丸项下质控内容为采用薄层色谱法鉴别川芎和白芷，采用高效液相色谱法测定欧前胡素含量，但并未涉及其中挥发性成分的检测。鉴于清眩丸中挥发性成分的重要性，本研究拟建立气相色谱法测定清眩丸中5种挥发性成分（薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮和藁本内酯）的含量，旨在更加全面地控制该药的质量。

1 材料

1.1 主要仪器

Clarus 500型气相色谱仪、火焰离子化检测器（FID）、TotalChrom色谱数据工作站均购自美国Perkin-Elmer公司；SB-5200DT型超声波清洗器购自宁波新芝生物科技股份有限公司；挥发油测定器购自成都蜀牛科技有限公司；AE240型十万分之一电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司；气相色谱柱DB-5石英毛细管柱购自美国Agilent公司。

1.2 主要药品与试剂

7批清眩丸样品分别购自山西华康药业股份有限公司（批号20210301、20201101）、北京同仁堂制药有限公司同仁堂制药厂（批号18013630、20010024、20010707）和河南润弘本草制药有限公司（批号200702、201103），规格均为每丸重6 g。薄荷、荆芥穗、川芎、白芷和石膏饮片均购自张仲景大药房郑州顺河路店，由笔者鉴定均为真品；薄荷脑对照品（批号110728-201707，纯度99.80%）购自中国食品药品检定研究院；薄荷酮对照品（批号PS020152，纯度94.44%）、胡薄荷酮对照品（批号PS012550，纯度99.50%）、胡椒酮对照品（批号PS020565，纯度95.00%）、藁本内酯对照品（批号PS011687，纯度98.00%）均购自成都普思生物科技股份有限公司。其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为DB-5石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；载气为氮气（纯度99.999%）；进样口温度为200 ℃；分流进样，分流比为10∶1，进样量为1 μL；程序升温：初始温度为100℃保持2 min，然后以5℃/min升温至220℃并保持2 min；FID温度为250℃；氢气流速为45 mL/min，空气流速为450 mL/min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品贮备液 分别精密称取对照品薄荷酮9.70 mg、薄荷脑13.18 mg、胡薄荷酮8.17 mg、胡椒酮7.80 mg、藁本内酯66.79 mg，置于同一25 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并定容，摇匀，即得混合对照品贮备液，其中薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本内酯的质量浓度依次为0.388、0.527、0.327、0.312、2.672 mg/mL。

2.2.2 线性关系考察用混合对照品溶液 分别精密量取上述混合对照品贮备液1、1、1、2、5 mL，分别置于50、25、10、10、10 mL量瓶中，加乙酸乙酯定容，摇匀，即得线性关系考察用混合对照品溶液。5种混合对照品溶液中，各待测成分的质量浓度由低到高依次为：薄荷酮0.008、0.016、0.039、0.078、0.194 mg/mL，薄荷脑 0.010、0.021、0.053、0.105、0.264 mg/mL，胡薄荷酮0.006、0.013、0.033、0.065、0.164 mg/mL，胡椒酮 0.006、0.012、0.031、0.062、0.156 mg/mL，藁本内酯0.053、0.107、0.267、0.534、1.336 mg/mL。

2.2.3 清眩丸供试品溶液 取清眩丸（批号20210301），剪碎，取约12 g（相当于2丸），精密称定，置于500 mL烧瓶中，加水200 mL；连接挥发油测定器，自上端加水至超过刻度并溢流入烧瓶时为止；再加入乙酸乙酯4 mL，连接冷凝管，加热回流提取4 h，放冷；由挥发油测定器上端小心吸取乙酸乙酯层，通过铺有少量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置于10 mL量瓶中；再以乙酸乙酯分次洗涤挥发油测定器和冷凝管，每次约2 mL，洗涤液通过同一漏斗并入量瓶中；加乙酸乙酯定容，摇匀，即得清眩丸供试品溶液。

2.2.4 缺薄荷、缺荆芥穗和缺川芎阴性对照溶液 按处方比例，分别制备缺薄荷、缺荆芥穗、缺川芎的阴性对照样品药材粉末；取上述粉末适量，按处方比例加入蜂蜜辅料，混匀；按“2.2.3”项下方法处理，即得缺薄荷、缺荆芥穗和缺川芎阴性对照溶液。

2.3 测定方法及系统适用性考察

按“2.1”项下色谱条件，精密量取混合对照品溶液（薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本内酯的质量浓度依次为0.194、0.264、0.164、0.156、1.336 mg/mL）、清眩丸供试品溶液、缺薄荷阴性对照溶液、缺荆芥穗阴性对照溶液、缺川芎阴性对照溶液各1 μL，依次注入气相色谱仪测定。结果显示，在该色谱条件下，各待测成分峰与相邻峰之间的分离度均大于1.5，5种待测成分的理论板数均大于10 000，色谱图见图1。由图1所示，混合对照品溶液色谱图和清眩丸供试品溶液色谱图中均可见5种待测成分的色谱峰，而在3种缺味阴性对照溶液色谱图中，则分别缺失相应成分的色谱峰（薄荷酮除外），表明其他成分对待测成分无干扰。

图1 混合对照品溶液、清眩丸供试品溶液和缺味阴性对照溶液的色谱图

2.4 线性关系考察

按“2.1”项下色谱条件，分别精密量取线性关系考察用混合对照品溶液及混合对照品贮备液各1 μL进样测定，以成分质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。结果表明，5种成分在各自的质量浓度范围内均与其峰面积成良好的线性关系（r均大于0.999 0）。

2.5 定量限和检测限测定

取线性关系考察用最低浓度的混合对照品溶液，逐级稀释并进样测定，以信噪比10∶1和3∶1时的质量浓度计为各待测成分的定量限和检测限。结果见表1。

表1 清眩丸中5种挥发性成分测定的线性关系考察及定量限、检测限结果

2.6 精密度试验

取清眩丸（批号20210301）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本内酯色谱峰面积的RSD依次为1.21%、1.23%、0.77%、0.73%、1.16%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取清眩丸（批号20210301）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、20、24 h时进样测定，记录峰面积。结果显示，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本内酯在24 h内峰面积的RSD依次为1.53%、1.27%、1.27%、0.98%、1.58%（n＝7），表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.8 重复性试验

取同一批清眩丸（批号20210301）样品，共6份，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，并采用外标法计算5种成分的含量。结果显示，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本内酯含量的RSD依次为1.19%、1.98%、1.04%、1.21%、1.30%（n＝6），表明本法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的清眩丸（批号20210301）样品6份，每份约6 g，置于500 mL烧瓶中，分别精密加入已知质量浓度的混合对照品乙酸乙酯溶液2 mL（薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本内酯质量浓度依次为0.216、0.435、0.472、0.151、2.807 mg/mL），混匀。按“2.2.3”项下方法制备加样回收供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果显示，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本内酯的平均加样回收率依次为96.33%、96.92%、97.53%、96.80%、95.61%，RSD依次为1.23%、1.38%、1.81%、1.89%、0.77%（n＝6），表明方法准确度良好。结果见表2。

表2 清眩丸中5种挥发性成分的加样回收率试验结果

2.10 样品含量测定

取7批清眩丸样品，剪碎，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用外标法计算。每个样品平行测定2次，取平均值。结果显示，7批样品中薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本内酯的平均含量依次为 0.009～0.070、0.040～0.157、0.017～0.150、0.008～0.049、0.144～0.932 mg/g。结果见表3。

表3 7批清眩丸样品中5种挥发性成分的含量测定结果（n＝2，mg/g）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

清眩丸中各种挥发性成分的含量差异较大，若用溶剂直接提取制备供试品溶液，含量较低的成分难以被检出，故本研究采用挥发油测定器提取并制备供试品溶液[1，21]。挥发油测定器上端加入乙酸乙酯，对比重大（藁本内酯）和比重小的挥发性成分均起到了富集作用。提取完成后，用溶剂分次洗涤冷凝管和挥发油测定器，可减少成分损失。蒸馏法制得的供试品溶液中主要含挥发性成分，可延长色谱柱寿命。

3.2 色谱柱的选择

笔者前期选用不同色谱柱测定后发现，采用色谱柱DB-WAX测定时，薄荷脑和胡薄荷酮色谱峰重叠，这可能是由于这2种成分的结构相似，在极性较强的色谱柱上难以分离；采用色谱柱DB-624分析时，色谱基线抬高，且藁本内酯的保留时间延长；而采用色谱柱DB-5分析时，各成分峰分离良好，故本研究选用色谱柱DB-5。

3.3 分析条件的选择

笔者前期以不同的柱温（80、100、120、150℃）进行实验，结果各成分难以分离，且高沸点成分的色谱保留时间太长；在程序升温条件下，以不同的初始温度（80、90、100℃）、终点温度（160、200、220℃）及不同的升温速率（2、5、10 ℃/min）进行对比实验，结果以“2.1”项下色谱条件的分离效果最佳。

3.4 主要挥发性成分的归属分析

根据色谱结果，缺薄荷阴性对照溶液色谱中未检出薄荷脑色谱峰，薄荷酮色谱峰亦降低（图1C）；缺荆芥穗阴性对照溶液色谱中未检出胡薄荷酮和胡椒酮色谱峰（图1D）；而缺川芎阴性对照溶液色谱中未检出藁本内酯色谱峰（图1E）。这表明清眩丸中薄荷脑和薄荷酮主要源自薄荷，胡薄荷酮和胡椒酮主要源自荆芥穗，藁本内酯主要源自川芎，与文献报道基本一致[10－13]。

3.5 样品含量测定结果的分析

本研究含量测定结果表明，藁本内酯含量最高，薄荷酮、胡椒酮含量较低。同一厂家不同批号样品中5种成分的含量相对稳定，而不同厂家样品中5种成分的含量差异明显，这可能与不同厂家选用的饮片来源、质量及加工工艺不同有关。另外，在2020年版《中国药典》（一部）中，仅薄荷项下有薄荷脑含量规定，而其他药材中挥发性成分的含量均无相应规定，这也可能是造成样品中各药材质量不一、各成分含量存在差异的原因。

综上所述，本研究所建立的气相色谱法简便、准确，能同时测定清眩丸中5种挥发性成分的含量，可更全面地控制其质量。建议在清眩丸的质量标准中增加挥发性成分含量测定项。