利用分子标记技术研究甜菜品种细胞质的育性基因型

夏雨晴，张于，吴则东，邳植

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

植物核质互作型雄性不育（CMS）由线粒体基因组和核基因组共同决定，与花粉不育表型相关，花粉不育表型可被称为育性恢复基因的核基因（Rf）抑制[1]。CMS是植物的一个重要性状，目前在150多种植物中均有发现[2]。甜菜是利用CMS杂交种子生产的代表作物[3]。

1945 年，OWEN 提出甜菜细胞质雄性不育（CMS）是由一个不育型细胞质（S）和两个Rf隐性基因（X 和Z）控制的，其中X 在育性恢复力上强于Z[4]。但他注意到甜菜CMS的表达有时过于复杂，不能用这个简单的遗传模型来解释，因为在杂交试验的后代中出现了半雄性不育类型。根据OWEN 的遗传模型，细胞质雄性不育甜菜具有S（xxzz）基因型。为了繁殖不育系，选育了不含恢复等位基因，但细胞质正常可育以保证花粉产生的保持系，即细胞质为N（可育型）细胞核基因为xxzz的类型。在这种杂交育种方法中，最重要的是保持系基因型的鉴定，因为不育系是由保持系与不育系祖先系反复回交而培育的。目前，甜菜杂交育种的一个主要问题就是保持系基因型的稀缺，使得保持系选择十分困难[5]。常见的甜菜保持系选育方法通常是鉴定法，通过不育株与拟鉴定株成对套袋育种，再根据其F1后代不育株的育性推测拟鉴定株是否具有保持能力。这通常需要4～6 年才能正确判断，耗时长且效率低。后来程大友等[6]利用以多胚一年生基因型不育系甜菜鉴定选育二年生单胚或多胚基因型保持系，仅需13～16 个月。尽管如此，甜菜不育系和保持系的鉴定与选育依然耗时较长。加快育种周期，早已成为各国育种家共同关注的问题[7]。

随着分子生物技术的不断发展，NISHIZAWA 等[8]发现了在甜菜线粒体基因组中的数目可变的串联重复序列（VNTR）具有多态性和4 个不相关的串联重复序列位点（TR1、TR2、TR3 和TR4），而其中TR1 串联重复序列的多态性最高，串联重复序列的数量为2～13 个不等。可以利用作用于甜菜线粒体VNTR 位点进行甜菜细胞质的育性鉴定。CHENG 等[9]通过对中国甜菜种质资源的研究发现，不同细胞质育性类型的小卫星序列的拷贝数具有多态性，其中细胞质为OWEN 不育型的TR1 片段有4 个拷贝，细胞质为保持系型的拷贝数为13 个。王有昭[10]也用此方法对甜菜主要品系进行VNTR分子检测时，在叶用甜菜中首次发现了一株特异类型细胞质，其TR1片段拷贝数为10个。其余试验结果与程大友的结果一致，经过测序发现，其TR1不育系扩增条带大小在500 bp 以下，保持系扩增条带大小在750 bp 左右。以这两个作为对照材料进行PCR 扩增，可以通过对比条带带型大小的方式来判断甜菜细胞质类型。

中国并非甜菜的起源国，虽然甜菜作为糖料作物栽培在我国已有100多年的历史，甜菜育种事业也在不断发展[11]，但仍然不及欧洲发达国家。目前世界各主要国家使用的甜菜品种大多为单胚细胞质雄性不育杂交的三交种[12]。在中国培育的甜菜品种，几乎都是与少数国内部分地区种植的自由授粉品种进行杂交而得来的。杂交种子的生产依赖于单一的不育系，即所谓的OWEN 型细胞质，它是由OWEN 在品种‘US-1’中发现的[9]。近年来，国内也育成了一些以甜菜细胞质雄性不育系为母本的单胚品种，但由于我国的单胚不育系和保持系的数量较少，限制了三交种母本的数量，也使得我国每年配制的杂交组合数目远远少于国外的育种公司，所以我国主要投入生产的甜菜品种多数引自于国外，而这些品种的育性组成情况我们并不清楚。

目前国外甜菜种业公司在我国占据大部分市场，国产甜菜种子受到国外甜菜种子的冲击较大[13-14]。随着单胚雄性不育丸粒化品种的需求量逐年扩大，市场上出现质量下降、假冒、掉包种子等现象；且国外品种的进入也造成我国甜菜褐斑病、丛根病、根腐病等病害加重，导致甜菜含糖率下降，影响了农业绿色生产发展进程，也使国内愈发依赖国外优良抗病品种[15]。为了更好地了解国内外甜菜品种的细胞质组成情况，基于甜菜细胞质线粒体基因组的变异，本试验以现有的109 个国内外甜菜登记品种的基因组DNA 为模板，利用已开发的作用于甜菜线粒体VNTR 位点的小卫星分子标记TR1 引物[7]，研究目前国内外甜菜品种的细胞质育性基因型，以提高甜菜育种效率，为我国甜菜产业的发展提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

试验材料为109 个国内外甜菜登记品种，及1 对自主培育的甜菜OWEN 型不育系和保持系作为对照组，共计110 份单株（表2）。所有甜菜品种的种子均由农业农村部全国农业技术推广服务中心提供。品种种植于黑龙江大学哈尔滨市呼兰校区试验田中。有部分发芽率较低的品种，则在黑龙江大学现代农业与生态环境学院的恒温光培室内补种，待长至1对真叶时即可采集其嫩叶用于DNA提取。

1.1.2 引物

试验所用引物为鉴定细胞质育性的TR1 引物[7]。引物序列如表1。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 试验中使用的DNA 标记Table1 DNAmarkers used in the experiment

1.1.3 试验试剂

1×CTAB 缓冲液、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、TE 缓冲液、超光速Mix、琼脂糖粉、1×TAE 溶液、G-Red荧光核酸染料。

1.1.4 试验仪器

震荡研磨机、金属浴锅、微量分光光度计、PCR仪、低速离心机、高速离心机、凝胶成像仪。

1.2 试验方法

1.2.1 CTAB法提取DNA

采用改良的CTAB法[16]提取109 个甜菜品种及保持系（O 型）和不育系（CMS 型）的DNA，每个品种取10株叶片的嫩叶单独提取DNA。

1.2.2 DNA浓度检测与稀释

提取完DNA 后，吸取1 µL DNA 原液，使用微量分光光度计检测DNA 浓度和OD260/OD280比值。保证OD260/OD280值≥1.8，浓度≥20 ng/µL。将所得的DNA 原液浓度用ddH2O 稀释为100 ng/µL，将原液放于-20 ℃冰箱中长期保存，再将稀释液放于4 ℃冰箱中保存，便于随时取用试验。

1.2.3 PCR扩增

10µL 的PCR 扩增体系含5µL超光速Mix，0.4µL引物，3.6µL的ddH2O，1µL的甜菜基因组DNA。PCR扩增条件为95 ℃预变性3 min；94 ℃变性25 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸2 min，循环28 次；72 ℃延伸5 min，16 ℃保存。

1.2.4 1%琼脂糖凝胶电泳及检测

PCR 扩增结束后，制备1%的琼脂糖凝胶，每100µL 的琼脂糖凝胶中加入5µL 的G-Red 荧光核酸染料。在每组样品中加入保持系（O 型）与不育系（CMS 型）DNA 的PCR扩增结果进行对比，吸取5µL 的PCR 产物进行点样，而后在130 V电压下电泳30 min左右。电泳结束后放入凝胶成像仪观察条带。

2 结果与分析

2.1 甜菜登记品种的细胞质育性鉴定

利用作用于甜菜线粒体VNTR 位点的细胞质鉴定引物TR1 对甜菜品种的基因组DNA 进行PCR 扩增后，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其育性结果。通过对109 个甜菜登记品种的细胞质基因型进行鉴定，可得知TR1 引物扩增出来的条带类型主要有500 bp 和750 bp 两种，即S 型细胞质（细胞质不可育型）和N 型细胞质（细胞质可育型）。对照组中自主培育的‘WZD-5CMS’不育系扩增出的条带为500 bp，‘WZD-5O’保持系的条带为750 bp左右。所鉴定的甜菜登记品种的扩增条带大多是500 bp，如表2所示。只有品种‘新甜15号’、‘ZT6’和‘甜研312’这3 个品种的扩增条带类型是杂合的，条带为500 bp 或750 bp。而这3 个品种都是我国自主培育的多胚种。

109个甜菜品种中的部分品种PCR扩增的电泳结果见图1。在每个品种前用标准的成对不育系（‘WZD-5CMS’自交系）和保持系（‘WZD-5O’自交系）作为对照组，依据对照组的条带大小可以看出品种‘KUHN814’的1～10 号扩增出的条带为500 bp，与不育系的条带一致，则可以认为该品种的细胞质都是S型。品种‘新甜15 号’的1～10 号扩增出的条带既有500 bp 也有750 bp，则该品种内的细胞质育性类型是杂合的，既有S型也有N型。

图1 部分甜菜品种的细胞质类型鉴定结果Fig.1 The cytoplasmic type identification results of some sugar beet varieties

所鉴定的109 个供试品种中，106个为S 型细胞质（不育型细胞质），占比97.2%，3 个为既有N 型（可育型细胞质）又有S型细胞质（不育型细胞质），占比2.8%。只有品种‘新甜15号’、‘ZT6’和‘甜研312’这3个品种内部的细胞质育性类型是混杂的，这3个品种都是我国自主培育的多胚种子（见表2）。

表2 供试材料的分子鉴定情况Table 2 Molecular identification of the test material

2.2 国内外甜菜登记品种多样性以及细胞质育性组成情况分析

如图2 所示，本次试验所使用的109个国内外甜菜登记品种中主要都是国外育种公司培育的品种，共有95个，占比为87%。其中自主培育甜菜种子最多的国家是荷兰，占比高达41%，其次是占比为14%的德国和13%的丹麦。国外的甜菜登记品种都是纯合的S型细胞质。

图2 供试材料的地区分布Fig.2 Regional distribution of test materials

在供试材料中，来自新疆农业科学院经济作物研究所、黑龙江大学等国内自育的地方品种有14 个，占比约为13%，其中的5个品种为单胚，9个品种是多胚，多胚种子中3个品种的细胞质类型既有S型也有N型。

3 讨论与结论

生产具有优良杂种优势效应的甜菜，需要具有高配合力的基因型进行杂交，配合力往往与基因型的遗传分化程度有关[17]。随着时代的发展，甜菜育种工作者们已不再通过挑选表型性状来进行这种选择，而是使用分子标记技术[18]。利用分子标记技术，还可以进行相应基因型品种的鉴定[19]。将多个抗性基因聚合到一起，实现聚合育种[20]。用分子标记辅助育种（MAS）的这种方法鉴定出甜菜细胞质基因是N 型还是S型是非常实用有效的方式，代替了常规育种鉴定法，即通过多代的套袋育种，观察其后代分离情况来判断拟选的保持系是否具有保持能力。分子标记辅助育种（MAS）为将来利用国外的优良甜菜品种育成能为我们所用的不育系、保持系以及授粉系服务，显著提高育种选择工作的准确性和研究效率。

本试验对现有的大部分甜菜登记品种的细胞质育性进行了鉴定，对照组中的‘WZD-5CMS’自交系为500 bp，即S型细胞质；‘WZD-5O’自交系为750 bp，即N 型细胞质。所鉴定的供试材料中S 型细胞质的比例为97.2%，品种中既有N 型又有S型细胞质比例为2.8%。由此可得，所使用的甜菜登记品种中大部分品种的细胞质是纯合的S型细胞质。只有品种‘新甜15号’、‘ZT6’和‘甜研312’这3个品种的细胞质育性类型是杂合的。而这3 个品种都是我国国内自主培育登记的多胚种子。由此可见，国外发达国家使用的基本都是单胚细胞质不育型种子，而我国自主培育使用的仍有多胚种，细胞质育性存在不一致的现象，也说明了种子的一致性较差。从试验的结果来看，目前国内外甜菜育种所用的亲本细胞质育性比较单一，鉴定结果均为OWEN 不育型，一旦产生对OWEN型雄性不育的病害，就会对甜菜产业造成致命的打击。

今后甜菜育种工作者应以丰产、高糖、抗病为目标，拓宽遗传基础[21-22]，注重选育多样化细胞质不育型的优良单粒种，丰富甜菜种质资源。同时提高品种的纯合性水平，母本细胞质需是纯合的不育型。建立对应的优质高效的分子标记辅助选育（MAS）体系[23]，加强甜菜抗病基因工程研究，加快甜菜抗病育种进程。本试验中仅对甜菜登记品种的细胞质育性进行了鉴定，而其核基因是哪种类型还需进一步的验证，因此，今后还需对甜菜登记品种的细胞核基因类型进行鉴定及研究。