基于紫外-可见光光谱法研究长期不同施肥对砖红壤溶解性有机质化学性质的影响

赵雄威，吴东明，李勤奋，王 旭*，陈 淼

1.海南大学生态与环境学院，海南 海口 570228 2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101

引 言

溶解性有机质(dissolved organic matter, DOM)，通常是指能够通过0.45 μm滤膜且溶于水、酸或碱溶液中的一种具有不同结构和分子量大小的有机分子混合物，广泛存在于土壤、沉积物和水体中[1]。DOM尽管在土壤中含量占比非常低，但具有极高的生物化学活性，是土壤生态系统中最活跃的有机组分。DOM对全球碳循环、生态系统的能量输入和物质循环具有至关重要的作用[2]。DOM对环境变化的响应很灵敏，能反映出土壤有机碳的动态变化[3]。研究表明，DOM的环境效应与其化学性质密切相关，包括芳香性、分子量和物质组成等。通常亲水性DOM可作为土壤中微生物的能量物质，对微生物的活性、丰富度和种群结构产生影响[4]。疏水性DOM能够与疏水性污染物产生较强的结合能力；含有较多亲水性官能团的DOM对重金属有着较强的络合和吸附能力[5]。因此，理解DOM化学性质将有助于评估和预测DOM的生态环境效应。

土壤中的DOM受土地管理措施影响显著[6]。有机-无机管理作为农业管理典型模式，其对土壤碳特征的影响，是土壤学和环境科学领域的研究热点[7]。研究表明，有机肥与化肥均能增加土壤中溶解性有机质含量[8]。也有研究认为，化肥的长期使用对土壤DOM没有显著影响[9]。迄今为止，大多数研究仅关注不同施肥方式对DOM数量的影响，而对DOM化学性质少有关注。近年来，紫外-可见光吸收光谱(UV-Vis)因操作简单、样品无损、信息量大等优点，在表征DOM方面得到广泛应用。它通过光谱特征、吸光度比值等方法可有效揭示DOM的分子量、芳香性等化学特性[7]。

不同施肥方式对土壤DOM的影响还与土壤类别密切相关。然而，过去大多关注潮土、黄土、黑土等温带土壤，对热带砖红壤少有关注。与温带土壤不同，砖红壤的pH低、有机质含量低、矿物组成丰富，可能导致施肥对土壤DOM产生的作用效应不同。理论上，低pH和有机质含量更有利于外源有机碳的固定；化学施肥可导致土壤矿物晶质化；有机施肥则相反[10-11]。假设：有机物料输入可能有利于增加土壤DOM芳香类物质的累积。化肥可能导致DOM的含量降低和结构改变。为验证该假设，以紫外-可见光光谱为表征手段，研究了连续四年不同施肥后砖红壤DOM的化学性质。研究结果将丰富土壤有机循环理论，并为热区砖红壤碳管理提供基础数据。

1 实验部分

1.1 试验地概况

试验地点位于海南省文昌市中国热带农业科学院环植所基地。地处东经110.46°，北纬 19.32°，土壤质地为砂壤土，土壤类型为砖红壤，肥力水平较低，土壤基本理化性质见表1。常年降雨量1 721.6 mm，雨季主要集中在5—10月份，占全年降水的79%。年均温度23.9 ℃，积温为8 474.3 ℃，为热带海洋季风气候。极端天气通常为夏季暴雨和春季干旱。

表1 供试土壤基本理化性质

1.2 样品采集

试验种植制度为辣椒-豆角轮作。试验共设计4个田间处理，分别为，①CK(不施肥)；②NPK(氮磷钾)；③OG(有机肥)；④ST(秸秆还田)；化肥分别为尿素、过磷酸钙和氯化钾，有机肥为羊粪。试验期间每年肥料施用量为：氮肥 300 kg·hm-2，磷肥200 kg·hm-2，钾肥300 kg·hm-2，有机肥24 000 kg·hm-2，秸秆3 200 kg·hm-2。2020年4月，于辣椒收获后，采用S形采样法采集0～20 cm的土壤样品，每个处理采集三个重复，运回实验室风干后过20目金属筛。

1.3 DOM的制备与定量

采用震荡法提取DOM[7]，称取过20目金属筛的风干土10 g于离心管中，加入超纯水50 mL(土水比例按照1∶5混合)，置于25 ℃、200 r·min-1震荡仪中震荡24 h，10 000 r·min-1离心10 min，将上清液过0.45 μm水系滤膜，即得到土壤DOM溶液。放于4 ℃冰箱中保存，用总有机碳/氮分析仪测定DOM中的DOC含量。

1.4 DOM光谱分析

用紫外-可见分光光度计测定DOM吸收光谱，以超纯水作为空白用以校准基线，选用200～700 nm的波段范围，以1 nm为间隔进行扫描，获得吸光度A，根据式(1)计算吸收系数A

αg(λ)=2.303A/b

(1)

式(1)中：λ为波长(nm)；αg(λ)为波长λ处的吸收系数(m-1)；b为光程路径(m)。对于DOM光谱性质的研究常用方法为利用吸光度表征DOM的化学性质，本研究中选取254 nm波长下单位吸光度值SUVA254用来表征DOM芳香性，SUVA254是DOM在254 nm下的吸光系数与DOC浓度之比，SUVA254越大，表示芳香化程度越高[12]；选取260 nm波长下单位吸光度值SUVA260和280 nm波长下单位吸光度值SUVA280分别用来表征DOM分子的疏水性和分子量；用波长250和365 nm处吸光度之比A250/A365表征DOM分子大小[2]，波长300和400 nm处吸光度比值A300/A400表征DOM腐殖化程度[13]，波长465和665 nm处的吸光度比值A465/A665表征DOM的蛋白质和碳水化合物含量[14]；利用355 nm处的吸收系数表征有色溶解性有机物的相对浓度[15]。

吸收光谱曲线斜率(S)是光谱模型中一种重要信息，本研究采用紫外波段光谱(275～295 nm)进行S值计算，公式为

α(λ)=α(λγ)e[S(λγ-λ)]

(2)

式(2)中：α(λ)为测定波长的吸收系数,α(λγ)为参照波长的吸收系数，选取S275～295反映DOM光降解程度，因为其对光辐射较为敏感。此外S275～295还提供了DOM组成特征信息，表征DOM分子量大小及光化学反应活性等，该S值大小与分子量大小呈反比[16]。

光谱斜率比值SR[见式(3)]

SR=S275～295/S350～400

(3)

有研究表明SR的相对稳定性较好，常被用来表征DOM的来源组成和结构变化[15]，SR与DOM浓度无关，SR值越高，则DOM分子量越低，代表着DOM多为最近产生或者以外源输入为主。当DOM以内源为主时或者光漂白作用较强时，则SR值较大[2]。

1.5 数据处理

2D-COS分析可通过信号峰之间变化的关系揭示不同DOM组分在生物降解中的反应顺序。首先，将获得的DOM紫外光谱数据集进行归一化处理，并形成矩阵。随后，采用2D-shige软件对紫外-可见光光谱进行分析，获得同步-异步图谱。采用Microsoft Excel 2018与Matlab2018b对紫外特性参数进行计算，利用SPSS26 软件进行数据分析，采用单因素方差分析比较不同处理间的光谱特征与DOC含量的差异性(p<0.05为显著差异)，相关性分析采用Pearson相关系数分析法(p<0.05为显著相关，p<0.01为极显著相关)，用Origin2021软件进行相关图表的制作。

2 结果与讨论

2.1 不同施肥模式对土壤DOM的影响

DOC是衡量土壤DOM碳库含量的重要指标。如图1所示，不同施肥方式下的土壤DOM含量具有显著差异，表明施肥对土壤DOM含量具有显著影响。DOM含量变化范围为15.32～104.89 mg·kg-1，由低到高分别为CF

图1 不同施肥处理下土壤溶解性有机碳含量

2.2 不同施肥下土壤DOM紫外-可见吸收光谱特征

利用紫外-可见吸收光谱能够反映出土壤有机质分子结构的复杂程度和腐殖化程度。四种管理措施中土壤DOM的可见吸收光谱特征如图2(a)，结果显示，在不同处理下，总体上吸收系数随着波长的增加不断递减，从650 nm以后吸收逐渐趋于0。但是不同施肥方式下土壤DOM的光谱曲线存在着显著差异，其中施用有机肥的土壤DOM吸收光谱向长波方向移动最明显，表明不同施肥方式下土壤DOM具有不同的化学性质。从图2(b)所示200～700 nm的变异系数来看也证明了这一点，其变异系数在44.80%～68.5%之间，变异系数在380和670 nm处出现了两个显著的峰值，进一步说明具有这种紫外吸收特征的物质对土地利用变化的响应非常灵敏。紫外-可见光谱曲线也能用于表征土壤DOM的化学性质。在图2(a)中可以看出260～280 nm处出现了显著肩峰，可能是由于土壤DOM含有两个双键的共轭体系(例如苯环、共轭二烯等)[2]。此外，在330～370 nm处还存在一个次级肩峰，说明土壤DOM中可能含有脂肪族醛酮化合物或者芳香族醛酮化合物。结果表明，施用有机肥会导致溶解性有机质的紫外-可见光谱图出现红移现象，表明其能够增加土壤腐殖化程度，显著提高土壤中的双键共轭物质含量。

图2 不同施肥处理下土壤溶解性有机质的紫外-可见光谱特征

2.3 不同施肥模式下土壤DOM的紫外特性参数分析

2.3.1 紫外光谱特征吸收值

采用DOM的紫外特征参数来表征DOM的化学性质。SUVA254，SUVA260和SUVA280三个特征值分别与芳香性、疏水性、平均分子量成正比。从图3(a,b,c)分别可以看出不同的施肥方式明显改变了土壤DOM的三种特征参数值，并且四种施肥方式中SUVA254，SUVA260和SUVA280三种特征参数呈现出相同趋势，均是有机肥>秸秆>不施肥>化肥。其中与CK处理相比，OG处理增加最为明显，SUVA254，SUVA260和SUVA280，三种特征参数分别增加了180.2%，180.0%和180.0%；ST处理下的三种特征参数没有显著变化，仅分别增加15.9%，15.8%和15.1%；而CF处理下土壤DOM的三种特征参数出现了明显的下降，下降幅度分别为41.0%，41.3%和43.9%。有机肥能够有效增加土壤DOM的芳香性、疏水性以及平均分子量，使溶解性有机质更加稳定，其原因可能是有机肥的腐殖化程度高，长期的有机肥施用增加了微生物和外源有机质的输入，使得土壤分子结构变化，复杂芳香族化合物的占比增加[19]。而化肥的施用可能导致土壤矿物出现晶质化现象[10-11]，从而导致土壤DOM结构的改变，使DOM含量减少。

图3 不同施肥处理下光谱吸收值SUVA254(a)，SUVA260(b)和SUVA280(c)

2.3.2 紫外可见光谱吸收比

不同施肥处理对DOM特征性紫外可见光谱吸收比也有影响。A250/A365表征土壤DOM分子量大小，其值越大，表示DOM分子量越小[2]。从图4(a,b,c)分别可以看出，相对于不施肥处理，不同的施肥方式下A250/A365均有着升高趋势，其中在施用化肥处理下A250/A365上升最多，上升幅度为7.7%，其他处理之间无明显差异，表明施用化肥使土壤DOM分子结构简单化。A300/A400能够反映DOM的腐殖化程度、芳香性结构等。A300/A400<3.5时，DOM是以胡敏酸为主；A300/A400>3.5时，DOM是以富里酸为主。施用化肥处理其A300/A400值为2.28明显低于3.5，说明施用化肥处理下土壤中主要以胡敏酸为主，而施用有机肥和施用秸秆处理下土壤A300/A400值高于3.5，说明施用有机肥和秸秆的土壤中主要以富里酸为主。A465/A665值能够表征DOM中的蛋白质和碳水化合物的含量[14]。由图4(a,b,c)可以看出，不施肥、施用化肥、施用有机肥和施用秸秆四个处理之间皆存在显著性差异，A465/A665值由高到低依次为施用秸秆、施用有机肥、不施肥、施用化肥。其中，施用秸秆相比不施肥处理增长了114.5%，施用有机肥相比不施肥处理增长了47.8%，而施用化肥相比不施肥处理降低了42.4%。

图4 不同施肥处理下光谱吸收比A250/A365(a)，A300/A400(b)，A465/A665(c)

2.3.3 吸收系数α(355)

355 nm波长处的吸收系数α能够表征有色溶解性有机质的浓度，α(355)值越大，表示有色溶解性有机质浓度越高[15]。四种施肥方式下土壤DOM吸收系数α(355)的变化情况如图5所示，α(355)的变化范围为33.09～165.05，其中α(355)含量最高的为OG，其值为165.05，相比CK，增加了175.6%，达到了显著水平；ST相比于CK，其含量仅增加11.7%，没有显著性提升有色溶解性有机质含量，CF处理下有色溶解性有机质含量最低，相比CK，CF差异非常明显，达到了44.7%。表明施用有机肥能够明显提高土壤中有色溶解性有机质的含量，其原因可能是大量腐殖质输入，使土壤DOM中生色团急剧增加[2]。

2.3.4S值与SR值

由表2可以看出四种施肥方式下，CF的S275～295值相比于CK出现明显升高，表明CF的土壤DOM的分子量降低，而CK与OG、ST之间没有明显差异。SR值能够表征DOM的来源组成[2]，从表2可以看出CF处理明显提升了SR值，表明CF的土壤DOM结构特征改变，而其他三组处理之间没有显著性差异。相关研究表明，当SR>1时，表征DOM的来源主要为生物源，当SR<1时，表征DOM主要为外源[20]。不施肥、施用有机肥与施用秸秆三种处理下，其SR值均小于1，因此三种处理下其外源特征十分显著。

表2 不同施肥处理下的S值与SR值

2.4 土壤DOM的特征参数相关关系

土壤DOM和特征参数的相关关系见表3，四种不同施肥方式下，紫外特征参数之间的相关性揭示了各参数的内在关系。可以看出SUVA254与SUVA260显著相关，表明了土壤DOM的芳香性和疏水性密切相关，土壤DOM中的芳香性结构有很大可能存在于疏水组分中；A2/A3与S275～295存在显著相关，表明了土壤DOM能够通过光降解将其中复杂的大分子有机质分解。SUVA254、SUVA260、SUVA280、吸收系数α(355)均与土壤中DOC含量存在显著正相关；A300/A400，A465/A665与土壤中DOC含量达到极显著正相关；S275～295，SR与土壤DOC含量分别达到显著负相关和极显著负相关。这些相关关系表明，紫外光谱吸收值、紫外光谱吸收比、S值和α(355)是评价土壤DOM的结构复杂程度的重要指标。

表3 土壤DOM与特征参数的相关关系

2.5 二维相关分析

为了进一步揭示土壤DOM化学结构对不同施肥方式的响应速度。将紫外可见光光谱数据中200～450 nm区域，进行二维相关分析处理(2D-COS)，获得它们的同步、异步谱图。2D-COS的同步映射通常包括自动峰和交叉峰。自动峰强度越大，对外界扰动引起的光强变化的敏感性越高，而交叉峰则反映了在两个不同光谱频率之间的光谱强度的协调变化。当强度变化的方向一致时，表明在相应处交叉峰为正；当强度变化方向不同时，则表示相应交叉峰为负[12]。图6中UV-Vis的同步(a)、异步(b)谱图可知，不同施肥模式下，响应最大的组分是200，250和350 nm组分，同时响应的先后顺序为250 nm>350 nm>200 nm。

图6 二维相关光谱图

3 结 论

(1)经过连续四年的试验，有机肥和秸秆均能提高土壤溶解性有机质的含量，能够改善土壤肥力，尤其是施用有机肥；与之相反，长期施用化肥明显降低土壤溶解性有机质的含量。

(2)四种处理下土壤溶解性有机质的紫外-可见光吸收光谱曲线特征中，有机肥的施用明显提高了土壤DOM吸光度，表明有机肥处理的DOM中存在共轭结构且腐殖化程度高，因而吸光能力较强；同时有机肥处理的紫外光谱显示在260～280 nm处有吸收峰，表明DOM发色团中可能有双键结构。

(3)施用有机肥处理的DOM中SUVA254，SUVA260，SUVA280三种特征值均高于施用化肥处理和不施肥处理，表明其土壤中DOM腐殖化程度高、芳香性和疏水性强。A2/A3和S275～295特征进一步表明了施用有机肥和施用化肥两者在DOM结构上的差异，即施用有机肥下土壤DOM的结构趋向复杂化。