表面增强拉曼光谱法快速检测猪肉中氟尼辛葡甲胺残留

张 茜，董祥辉，姚卫蓉，于 航，谢云飞

江南大学食品学院，江苏 无锡 214000

引 言

氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine，FM)CAS号：42461-84-7，结构式如图1，是唯一动物专用的非甾体类抗炎药物(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)，由增溶剂葡甲胺与氟尼辛以1∶1的形式结合而成。1996年，由Doran等研产, 美国SINEBOR公司将其做成商品名为Banamine的注射液, 用于动物疾病治疗[1]。2007年6月1日，齐鲁动物保健品有限公司独立研制并申报的FM被农业部批准为国家三类新兽药[2]。

图1 FM的结构式

FM是一种强效环氧化酶抑制剂，通过选择性抑制的环氧化酶来阻止血栓烷素、前列腺等炎性物质的生成，从而起到消炎、解热、镇痛的作用。临床上常用于缓解猪、马、牛的内脏、肌肉、骨骼、乳房、子宫紊乱等引起的炎症及绞痛，以及传染病引起的各种急性炎症的控制、犬内毒素血症的治疗等[3]。因其具有给药量小、吸收迅速、持续时间长、疗效显著、不良反应轻等特点[4]，深受兽医青睐，是目前国内外兽医临床上消费量最大的NSAIDs。近年来，随着氟尼辛葡甲胺在兽医临床上的广泛应用，其不良反应液逐渐凸显。多表现为胃肠道的毒副作用，如犬、猫的呕吐、腹泻和胃肠溃疡[5]。因此，建立确证有效的检测方法，对于FM在兽肉中的残留检测，至关重要。

国内外文献报道中，针对肉类食品中FM或F(氟尼辛)的检测方法主要有高效液相色谱法[6]、液质联用法[7]、分光光度法[8]、IC-Elisa法[9]。但这些方法存在设备昂贵，前处理、检测操作复杂，不便携等缺点，因此极大地限制了其在现场快速检测中的应用。而便携式拉曼光谱技术具有便携、快速、指纹识别等优点，能克服上述方法带来的不便，因而被广泛用于动物源食品中兽药残留检测。如翟晨等[10]基于SERS技术，以银溶胶为增强基底，建立了肝脏与肌肉组织中沙丁胺醇的定量检测方法，其回收率分别为91.2%和92.1%。Shao等[11]以银溶胶为增强基底，建立了鸡鸭肉中二硝基胺和托曲唑的SERS检测方法，回收率分别为95.67%，105.39%和94.79%，99.44%，徐宁[12]以金溶胶为增强基底，结合SERS检测与主成分分析法，建立了SVM模型，对鸡肉中磺胺类药物进行快速检测。

据文献调研，目前国内外均无与FM相关的SERS检测方法的报道。因此，本研究以金溶胶作为SERS增强基底，通过优化FM的检测条件与猪肉中FM的提取条件，建立了猪肉中氟尼辛葡甲胺残留的SERS检测方法，实现猪肉中FM的快速筛查检测。

1 实验部分

1.1 试剂

氟尼辛葡甲胺(FM，纯度99.77%，购于西弗沃实验室)；氯金酸钾(纯度97.0%)、柠檬酸三钠二水合物(纯度99.0%)购于南京森贝伽生物科技有限公司；提取中所用有机试剂均为色谱级，无机试剂均为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 设备

便携式拉曼光谱仪(RamTracer-200-HS，美国欧普图斯公司)；磁力油浴锅(ZNCL-S，巩义市京华仪器有限公司)；超纯水制备仪(Direct-Q 5UV，Millipore公司)。

1.3 金溶胶基底的制备

通过柠檬酸钠(1%)还原氯金酸钾(10 mg·mL-1)法制备增强基底。实验所用玻璃器皿、转子均用王水泡12 h，之后用超纯水冲洗六次，烘干备用；将油浴锅升温至120 ℃；设置磁力搅拌器参数为565 r·min-1；在圆底烧瓶中加入47 mL超纯水、3 mL氯金酸钾充分混合，放入120 ℃油浴锅内，同时启动磁力搅拌器搅拌至沸腾；加入2 mL还原剂，沸腾20 min；冷却备用，4 ℃存放。

1.4 样品处理

称取2.5 g绞碎猪肉于离心管中，加入2 mL 10%(W/V)Na2CO3溶液，涡旋2 min混匀；加入5 mL乙酸乙酯进行液液萃取，涡旋2 min，离心；取上清溶液于另一离心管中，残渣用5 mL乙酸乙酯重复萃取一次。将两次上清液合并，之后于40 ℃氮吹浓缩至5 mL。加入乙腈5 mL、乙腈饱和正己烷7.5 mL除脂质。涡旋2 min，离心，尽除去上层液体以及上下层交界处薄薄的一层液体，下层液体转入另一离心管。将下层液体重复除脂一次。将最终得到的下层清液在45 ℃条件下氮气吹干，用2 mL甲醇复溶，用于检测。离心条件均为10 000 r·min-1、4 ℃和10 min。

1.5 SERS光谱采集

在包覆锡箔纸的玻璃片上，将金溶胶与液体样品按一定比例混匀。用激发光源为785 nm的便携式拉曼光谱仪进行扫描，扫描功率150 mW，扫描时间10 s，扫描次数5次。每一个样品采集10张光谱图，做平均拉曼光谱。FM固体样品光谱采集时，直接将FM粉末放在锡箔纸上进行采集，采集条件同液体样品。

1.6 密度泛函理论计算

为了对FM的拉曼峰进行归属指认，采用密度泛函理论(density functional theory，DFT)，模拟了FM的理论拉曼光谱。操作如下：使用Gauss View 5.0 软件构建FM分子模型；分别对氟尼辛和葡甲胺分子进行几何构型优化，之后采用同样的几何优化方法，将已经优化好的氟尼辛、葡甲胺分子放在一起进行几何优化。采用Gaussian 09程序进行DFT计算，计算关键字为“freq=raman b3lyp/6-311g(d)”。将理论拉曼光谱图与固体拉曼光谱图对比，进行峰归属指认。

2 结果与讨论

2.1 理论计算光谱

图2(a)为FM在DFT计算中的结构优化图，葡甲胺分子的位置与氟尼辛中羧基位置较为接近。图2(b)为固体拉曼光谱与理论计算拉曼光谱的比较，理论光谱矫正因子为0.966。可看理论计算谱图与固体拉曼谱图存在部分偏差，如普通拉曼出峰位置为429 cm-1，而理论计算光谱的出峰位置为397 cm-1。由于实际检测条件与理论计算中的理想条件有出入，在出峰情况上，二者也存在在一定的差异，如理论计算光谱中824～1 085 cm-1范围内有峰，而固体拉曼光谱中没有出峰；理论计算光谱在1 597～2 000 cm-1范围内出峰，而固体拉曼图没有出峰。理论计算中设定物质处于真空环境，而实际实验中FM以粉末存在，有分子间作用力以及外界非真空环境的影响。

图2 优化后的结构式(a)，蓝、红、灰、白、绿球分别为N、O、C、H、F原子；理论计算拉曼光谱与固体拉曼光谱比较(b)

2.2 检测条件优化

对样品与金胶之间的体积比进行了优化。结果如图3(a)所示，随着金溶胶体积比增大，731 cm-1处的SERS信号先增强后减弱，当样品与金溶胶的体积比为1∶31(V/V)时，SERS增强效果最好。在此过程中，金纳米粒子上有限的活性位点与样品浓度共同影响了SERS强度。1∶3前，活性位点占据主导影响因素。此时随着金纳米粒子的增多，吸附的样品分子数增多，因此SERS信号逐渐增强。1∶3时，活性位点饱和，此时SERS效果最好。1∶3后，金溶胶对FM浓度的稀释作用逐渐占据主导地位，因此SERS信号逐渐减弱。

金溶胶中，纳米粒子之间的热点距离对增强待测物信号有很大的影响，合适的聚沉有利于缩短纳米粒子之间的热点距离，提高增强效果。在柠檬酸钠还原氯金酸钾制备金溶胶中，过多的柠檬酸根离子充当稳定剂，包裹在金纳米粒子周围，进而防止金纳米粒子的过度聚沉，pH的变化与促凝剂的添加都容易破坏该静电保护层，从而影响增强效果。

FM甲醇溶液的pH为6.5，在调pH后，从图3(b)可以看出，pH在5～6时，731 cm-1处的SERS信号最好，过度调酸与调碱都会使拉曼信号减弱。促凝剂的添加，会使纳米颗粒聚集，在增加热点的同时也增加了分析物的吸附，因此能极大地提高SERS增强效果。因此，实验选取了NaCl，KI，NaBr和MgSO4四种盐溶液，探究促凝剂对FM的增强效果的影响。实验结果如图3(c)所示，促凝剂加入后，SERS信号并没有得到增强，反而更弱。出现该现象的可能原因是加入促凝剂后，完全破坏了金溶胶静电平衡，使其聚沉为大颗粒。此时比表面积减小，热点数目也减少，所以增强效果反而减弱，甚至消失。

图3 金胶体积比(a)、样品pH(b)、促凝剂(c)对FM SERS信号的影响

2.3 标准溶液的定性定量检测

根据上述优化结果，最终选择10 μL样品，30 μL金胶，将待测样品的pH调至6，不加任何促凝剂作为制样条件，功率为150 mW，积分时间10 s，积分次数5次作为检测条件。对0.1～1 000 mg·L-1FM甲醇溶液进行SERS检测，测试光谱如图4所示。

图4 不同浓度FM甲醇溶液的SERS谱图

发现在731，1 085和1 376 cm-1处，当浓度低至0.98 mg·L-1时，仍可看见微弱的峰，浓度继续低至0.1 mg·L-1时，1 376 cm-1处仍有极其微弱的峰出现，但是731和1 085 cm-1处完全无峰。因此甲醇溶液中FM溶液的检测限为0.98 mg·L-1。分析了图中典型峰位731，1 085和1 376 cm-1等处的线性拟合情况，结果如表2所示，在0.98～125 mg·L-1范围内都具有良好的线性关系。

表1 各波数线性拟合

2.4 实际样品提取方法优化

FM易与猪肉基质结合，不利于加标后的萃取。因此，为使FM与基质分离，使用强酸(6 mol·L-1HCl，90 ℃，2 h)、酶(β-葡萄糖苷酸酶、常温、5 h)将猪肉水解，再进行萃取。结果如图5(a)所示，两组组均没出现特征峰。强酸水解、酶解使蛋白、脂质被分解小分子物质, 导致萃取后的净化难度增大，因此在检测时基质干扰极大，无特征峰出现。考虑到上述情况，尝试通过调节提取环境酸碱的方式来进行萃取前处理。将2 mL 10%Na2CO3与0.1 mol·L-1HCl加入到猪肉中，之后再进行萃取。实验结果如图6(a)所示，10% Na2CO3组在731, 1 085和1 376 cm-1处出现特征峰。而0.1 mol·L-1的HCl处理没有出现特征峰。因此加入10%Na2CO3进行萃取前处理方法。

FM易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等溶剂，实验比较了这几种常用萃取剂的萃取效果。如图5(b)所示，使用乙酸乙酯萃取时，基质干扰较少，加标组(200 mg·L-1FM)在731, 1 085和1 376 cm-1等处出现特征峰。而当萃取剂为甲醇、乙醇时，无特征峰出现。可能原因是肉类中含有的蛋白质会与乙醇、甲醇反应产生变性现象，导致反应产物的干扰太大，从而无法出特征峰。而选用乙酸乙酯作为萃取剂时，基质干扰小。因此，后续实验加入10% Na2CO3进行萃取前处理，然后再用乙酸乙酯进行液液萃取。

图5 萃取环境(a)与萃取剂(b)的影响

2.5 实际样品的检测

如图6(a)所示，确定731, 1 085和1 376 cm-1为其特征峰。选731 cm-1作为定性定量峰，采用空白样本基质液加标的方法绘制标曲。图6(b)所示，在1～250 mg·L-1内，基质加标液的浓度与拉曼峰强之间具有良好的线性关系，其R2为0.99，拟合方程ISERS=49.13XC+3 359.5。通过回收率实验预测线性拟合方程的准确性，对理论浓度分别为200，100和50 mg·L-1的猪肉加标液进行SERS检测。其平均回收率在89.61%～95.63%，RSD在1.80%～3.30%，猪肉中的检测限为1 mg·kg-1。

图6 实际样品出峰(a)；731 cm-1处FM浓度与SERS强度之间的线性拟合关系(b)

3 结 论

通过对比FM甲醇溶液与甲醇溶液SERS光谱图，确定了FM的特征峰，并运用密度泛函理论计算，对这些峰进行归属确认，其中731 cm-1为吡啶环、苯环的面外摇摆，以及C—F摇摆，1 085和1 376 cm-1为苯环、吡啶环上C—H摇摆；接着对FM甲醇溶液进行了半定量分析，建立了猪肉中FM残留的SERS检测方法。其在猪肉中的检测限为1 mg·kg-1，线性范围在1～250 mg·L-1，检测的回收率为89.61%～95.63%，RSD在1.80%～3.30%。本方法快速、稳定、结果确证，适用于现场快速检测。但其检测限偏高，不能达到国家最大残留限量的灵敏度。因此如何降低其检测限，值得进一步研究。