江苏甘薯上常见病毒种类鉴定及多样性分析

罗勤川，唐 伟，孙厚俊，马居奎，杨冬静，陈晶伟，王 芳，谢逸萍，张成玲*

（1.江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/中国农业科学院 甘薯研究所/农业农村部 甘薯生物学与遗传育种重点实验室，江苏 徐州 221131；2.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040）

甘薯［Ipomoea batatas （L.） Lam.］ 是我国主要的粮食作物之一，因其营养丰富而成为世界卫生组织推荐的最佳食物，其还是能源、饲料、食品加工等主要原料之一，近年来甘薯植株也作为观赏植物出现在人们的视野里。甘薯具有独特的耐贫瘠和适应性广的特点，分布于世界 上100 多个国家和地区。我国是世界上第一大甘薯生产国，据统计，我国以占全球 29.0%的甘薯种植面积贡献了57.0%的产量。我国甘薯的种植面积和产量均居世界第一，单产是世界平均水平的 1.74 倍［1-2］。甘薯病毒病的发生严重影响了甘薯的产量和品质，尤其是近几年甘薯上不同病毒的复合侵染，造成了甘薯叶片黄化、明脉、皱缩，植株矮小，多分枝，不结薯或结薯小、薯块裂皮等。甘薯一旦感染病毒，终生带毒，并随着病毒在甘薯薯块和薯苗中不断积累，进而对甘薯的品质和产量造成不可估量的损失［3-5］。

据报道，全世界已经鉴定出的能侵染甘薯的病毒有9个科32个种［4］，主要包括马铃薯Y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯轻型斑点病毒（Sweet potato mild speckling virus，SPMSV）、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）、 甘薯 G 病毒（Sweet potato virus G，SPVG）、 甘薯 C 病毒（Sweet potato virus C，SPVC）等，毛形病毒属的甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）和甘薯病毒属甘薯轻斑驳病毒（Sweet potato mild mottle virus，SPMMV）等［5］。在我国已经检测出的20余种甘薯病毒中［6-10］，由马铃薯Y病毒属病毒尤其是SPFMV与SPCSV协生侵染造成的甘薯病毒病的发生较为严重，在全国各地均有相关的报道，一般会造成产量损失 20%～40%，严重时造成甘薯减产幅度达50%以上，甚至绝收［9-11］。

SPFMV是典型的马铃薯Y属病毒属，基因组为+ssRNA，编码1个大的开放阅读框（open reading frame，ORF），通过水解酶酶切形成10个成熟蛋白。其中根据外壳蛋白（Coat Protein，CP）氨基酸及核酸序列将SPFMV分成3个株系：O、EA和RC［12］，这3种株系在中国均有发生，其中O株系为主流株系［13］。SPCSV为二分体病毒，其基因组有2条+ssRNA，能与多种病毒协生侵染甘薯引起更为严重的产量损失。根据血清学可将SPCSV分为WA和EA这2个株系，这2个株系在我国均有报道，其中WA株系更为普遍［14］。目前关于江苏省甘薯病毒的种类鉴定以及对SPFMV、SPCSV等种群变化暂未有相关报道。

近年来，全国各地对甘薯病毒病的发生种类及发展趋势报道越来越多，但是江苏地区关于甘薯病毒种类的报道较少，为明确江苏甘薯种植区甘薯病毒病原物的种类及发生趋势，本研究对2014、2016和2018年采集到的29个甘薯样品，利用分子生物学方法进行鉴定和遗传多样性分析，以期对甘薯病毒病发生的预测及防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2014～2018年，分别从江苏徐州、连云港、盐城等地采集表现植株矮化、叶片皱缩、畸形、花叶等疑似病毒病的甘薯样品29个，每个样品分为2份，1份作为接穗，嫁接到巴西牵牛（Ipomoea setosa）上，另1份样品经液氮冷冻后放置于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2 试验方法

嫁接检测：将巴西牵牛种子清洗干净，放到121 ℃灭菌的培养皿中，加入灭菌水漫过种子浸泡12 h后，倒掉水后保湿直到种子冒出白色根后播种到小花盆中，每盆2棵。出苗后生长到4～6叶期时，距离最下面1叶下方约5 cm处，用消毒过的刀片斜向下切出接口，取发病甘薯枝条作为接穗，嫁接到巴西牵牛上，封口膜封住伤口，放置在自然条件下，采用防虫网罩住，培养10～20 d观察并记录巴西牵牛新生叶有无皱缩、褪绿、花叶等症状。

分子检测：取1 g左右叶片样品，采用多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司提供］提取植物总RNA，利用cDNA 反转录试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司提供，takara］合 成cDNA，用 SPFMV、SPVG、SPVC、甘薯病毒2号（Sweet potato virus 2，SPV2）、SPCSV、SPMSV、黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）、SPMMV、SPLV、甘薯褪绿斑病毒（Sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV）等10种病毒特异或兼并引物（表1）对样品进行 RT-PCR检测，通过PCR SuperMix扩增目的片段后回收产物，将回收产物连接到pMD19-T simple载体上，转化到大肠杆菌中，利用菌液PCR鉴定，将阳性克隆回收产物送生工生物（上海）有限公司测序，每个分离物选取3个重组子进行序列测定，确定其核苷酸序列。

表 1 用于RT-PCR检测病毒的引物

1.3 数据分析

采用Excel 2010软件进行数据分析和作图。获得的序列在NCBI上进行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），下载相关序列，利用DNAMAN和SDT（http://web.cbio.uct.ac.za/～brejnev/）软件来进行序列比对，用MEGA 6.0软件（http://www.megasoftware.net）中的最大简约法（Maximum likelihood，ML）构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病毒检测和种类鉴定

将所采集到的病毒样品嫁接到健康巴西牵牛植株上，巴西牵牛均发病，新生叶片产生皱缩、褪绿等症状。不同样品的叶片症状不完全一致，说明所有样品均被病毒侵染，且病毒种类不同。

用SPFMV、SPVG、SPVC、SPV-2、SPCSV、SPMSV、CMV、SPMMV、SPLV、SPCFV等10种病毒引物对采集的甘薯疑似染病的样品进行 RT-PCR检测，结果显示，所有的样品均有检测出病毒，但不同样品侵染的病毒种类不同。在所有样品中，SPFMV检出率最高，29个样品中仅有4个样品未检测出该病毒，其余样品检测为阳性，阳性率为86.2%，每年的阳性率相差不大，均在80%以上（图1）。SPV2、SPVC和SPCSV阳 性 率 均 在50%以上，SPVC在2016年的样品检测出阳性率最高为83.3%，其余2个年份的阳性率维持在43.0%左右；SPCSV出现逐年递增的发生趋势，2018年的阳性率最高为81.3%；SPV2在2014年和2018年被检测出，但2016年未检测出阳性样品，而SPVC在2016年的检测出阳性率最高。SPVG和SPLV阳性率最低，仅在2018年的样品中出现1个阳性，SPMMV和CMV也仅在2018年的样品中检测出阳性。2014年SPCFV的阳性率为28.6%，2016年增加到50%，但2018年未检测到该病毒。

图1 各年份及3年不同病毒检测阳性率

2.2 甘薯病毒病的复合侵染

病毒检测发现，江苏地区甘薯病毒病的发生主要以3～5种病毒复合侵染为主，复合侵染率占比在62.1%，又以3种病毒病原复合侵染较为普遍，占复合侵染的29.2%。每年的甘薯病毒侵染的病毒种类不同，2014年主要以SPFMV、SPVC和SPV2这3种病毒复合侵染为主，2016年以SPFMV、SPVC和SPCFV这3种病毒复合侵染为主， 2018年以SPCSV、SPFMV、SPV2、SPMMV及CMV等5种病毒复合侵染为主。

2.3 甘薯病毒系统进化分析

扩增马铃薯Y病毒属病毒SPVC、SPV2和SPFMV病毒多聚蛋白基因的部分序列及SPCSV的部分cp基因序列，并进行序列分析。结果表明，共获得SPFMV江苏分离物的基因序列，序列长度为589 bp，包括有511 bp 的cp基因部分序列及78 bp非编码区序列，构建系统进化树后发现，SPFMV分离物分为2个组，Ⅰ组分离物属于O株系，包括本研究的2个分离物，这些分离物与国内分离物MK778789（O-shaan-17-5）和MK778790（O-su-17-10）分离物一致率最高，达94.1%～99.5%，系统进化树上聚为一组；Ⅱ组包括O和RC株系分离物，本研究获得的JS16-3分离物与O株系MK778792（O-wan-17-3）等分离物聚为一簇，JS15-1、JS18-5分离物与RC株系GU478326（R5）等分离物聚为一簇。SPVC获得的片段长度为836 bp，包括755 bp的部分cp基因序列和81 bp的非编码区核苷酸序列，构建系统进化树发现SPVC也分为2个明显的组，其中JS18-41和JS18-64分离物与国内分离物MK778817（gan-17-1）聚为一组，而其余分离物与韩国分离物KP115622（UN202）、中国分离物等MK778816（24-1）聚为一组。SPV2片段长度368 bp，包括302 bp的cp基因序列和67 bp非编码区，构建系统进化树后也分为2个组，本研究获得的3个 分 离 物JS18-113、JS18-111和JS18-43与MK778812（su-17-8）等分离物聚为一组，其余分离物与美国分离物KC962219 （SPV2-NC）聚为一组。SPCSV构建系统进化树，结果表明：江苏分离物在EA和WA组中均有分布，其中JS16-4与秘鲁分离物HQ291260和国内分离物HM773432等聚为一组，其余分离物与WA分离物聚为一组（图2）。

图2 利用ML法构建不同病毒基因片段的系统进化树

3 小结与讨论

目前对甘薯病毒病的检测通常采用免疫学（ELISA）、电镜观察、分子生物学和指示植物。指示植物法是利用灵敏度高、易受病毒侵染和症状表现明显的巴西牵牛，嫁接发病甘薯枝条10～20 d后，受病毒侵染的巴西牵牛基本上能表现症状。此方法相对免疫学和电镜观察具有简单易学、成本低、灵敏度高等优点，因此笔者采用嫁接巴西牵牛和分子生物学方法进行病毒检测。结果表明，嫁接的巴西牵牛均发病，所有的样品均被病毒侵染，但是不同样品的叶片症状不完全一致，说明不同样品所含有的病毒种类不同，从而导致在巴西牵牛上产生的症状不完全相同。分子生物学检测表明，甘薯病毒病种类繁多，10种RNA病毒均被检出，常见的主要有马铃薯Y病毒属病毒SPFMV、SPV2、SPVC等及SPCSV。马铃薯Y病毒属病毒与毛形病毒属病毒SPCSV协同发生是云南、山东乃至全国、世界甘薯种植区近几年发生危害比较严重的病害［6-8，17］，本研究结果也验证了这一结果。SPCSV在2016年和2018年的样品中阳性率高，同样，SPMMV、SPMSV、SPLV和CMV等病毒也仅在2018年的样品中检测到阳性，有2个原因造成这种情况：一是2014年样品量少，二是这些病毒在江苏可能处于刚扩展趋势，在生产上需引起重视。

甘薯病毒病发生的一个主要特点是多种病毒的复合侵染，从而引起更为严重的产量损失［20-22］。本研究明确，甘薯上RNA病毒复合侵染率达到62.1%，对单种病毒侵染的样品并不排除有DNA病毒侵染的可能性，因此，实际上甘薯病毒病的复合侵染率会更高［23］。复合侵染主要以马铃薯Y病毒属病毒与毛形病毒属病毒SPCSV复合侵染为主，也是造成近几年甘薯病毒病SPVD流行的主要原因。SPFMV是SPVD中的一个重要病毒，存在EA 、O和RC 这3个株系，在我国SPFMV的3种株系均有报道，本研究获得的分离物存在O和RC 株系，其中O株系是江苏的主流株系，未发现EA株系。SPVC是与SPFMV亲缘进化关系较近的一种病毒，与SPFMV一致率较高，在江苏甘薯上大量存在，超过SPFMV-O株系，系统进化树将其划分为2个明显的组，说明马铃薯Y病毒属病毒种群可能已经产生新的变化［6］。SPV2系统进化分析表明，江苏分离物也分为2个组，大部分分离物与美国分离物KC962219亲缘关系较近，分为1个组中。SPCSV有2个株系，分别为EA株系和WA株系，这2种株系在我国均有报道，相对WA株系，EA株系在我国报道较早，但本研究获得的江苏分离物大部分属于WA株系，可能WA株系分离物在江苏分布区域较广。

甘薯属于无性繁殖材料，病毒能在薯苗和薯块中积累，对甘薯田间病毒的检测能预测第2年种苗质量，从而可对病毒的发生提出预警，对病毒病的防治起着至关重要的作用。目前，江苏省大田期甘薯病毒种类繁多且协同发生严重，可导致病毒种群结构的变化，增大防控难度，因此进一步加强病毒检测力度，规范引种和留种，可防止病毒的进一步扩散和发展。