扫描电子显微镜在鹌鹑蛋壳表征中的应用

郑 希，戎念杭

（浙江大学 农生环测试中心，浙江 杭州 310058）

鹌鹑蛋具有很高的营养价值，广受消费者喜爱.蛋壳保护蛋免受外界机械损伤，以及阻挡外部病菌侵害[1].不同于鸡、鸭、鹅的蛋，鹌鹑蛋表面还分布有颜色深浅不一的不规则斑点，这些图案对蛋可能起到保护色的作用[2].目前，有许多利用扫描电子显微镜技术对鸡、鸭、鹅蛋壳的结构进行观察的报道[3-12]，但人们对鹌鹑蛋的蛋壳结构的报道却很少.本研究利用扫描电子显微镜及能谱技术对鹌鹑蛋蛋壳结构进行观察，并对表面的深褐色、浅黄色部分进行对比分析，以期对鹌鹑蛋蛋壳的微观结构有深入了解，为禽蛋研究提供借鉴.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

GeminiSEM 300型扫描电子显微镜（SEM，德国卡尔蔡司），XFlash 6|30型能谱仪（EDS，德国布鲁克），E1010型离子溅射仪（日本日立），碳导电胶（日本日新）.鹌鹑蛋样品采购自杭州骆家庄菜场.

1.2 试验方法

取鹌鹑蛋蛋壳深褐色、浅黄色区域，将未擦去外表色斑的和擦去外表色斑的鹌鹑蛋壳的外表面、内表面、横截面分别粘在扫描电子显微镜样品台上，离子溅射仪喷金镀膜，放入扫描电子显微镜中进行观察.

2 结果与讨论

2.1 横截面的扫描电子显微镜观察

鹌鹑蛋蛋壳微观结构包含5层（如图1所示），由内向外分别是壳膜层、乳突层、海绵层、垂直晶体层和角质层，深褐色区域[如图1（a）所示]和浅黄色区域[如图1（b）所示]厚度不同，其中壳膜层、乳突层、海绵层、垂直晶体层厚度无明显差异，主要差异为角质层的厚度，深褐色区域比浅黄色区域厚.擦去外表颜色，扫描电子显微镜观察乳白色部分的横截面[如图1（c） （d）所示]，发现除角质层外，其余4层的结构都尚在，且厚度没有明显差异，说明鹌鹑蛋蛋壳表面深褐色和浅黄色的色斑来自于角质层.

图1 鹌鹑蛋蛋壳横截面的扫描电子显微镜照片（a）鹌鹑蛋蛋壳的深褐色区域，（b）鹌鹑蛋蛋壳的浅黄色区域，（c）擦去颜色后鹌鹑蛋蛋壳的深褐色区域，（d）擦去颜色后鹌鹑蛋蛋壳的浅黄色区域（Bar=50 μm）Fig.1 SEM images of cross sections of quail eggshell(a) dark brown area of quail eggshell, (b) light yellow area of quail eggshell, (c) dark brown area of quail eggshell after wiping off color, (d) light yellow area of quail eggshell after wiping off color (Bar=50 μm)

2.1.1 角质层

鹌鹑蛋蛋壳的深褐色区域比浅黄色区域厚[如图2（a1） （b1）所示].放大可见34～680 nm大小不一的球形颗粒，深褐色区域颗粒连接较为疏松，颗粒之间有大量空隙，轮廓更为清晰[如图2（a2）所示].浅黄色区域的颗粒之间的空隙填充致密，仅有少量纳米级的小孔[如图2（b2）所示].

图2 鹌鹑蛋蛋壳角质层横截面的扫描电子显微镜照片（a1）（a2）深褐色区域（Bar=5 μm，300 nm），（b1）（b2）浅黄色区域（Bar=5 μm，300 nm）Fig.2 SEM images of cross sections of stratum corneum in quail eggshell(a1) (a2) dark brown area of quail eggshell, (b1) (b2) light yellow area of quail eggshell

2.1.2 垂直晶体层

垂直晶体层主要为长条状的晶体，紧密排列，方向基本垂直蛋壳表面（如图3所示）.深褐色区域[如图3（a1） （a2）所示]和浅黄色区域[如图3（b1）（b2）所示]在扫描电子显微镜下观察未见明显区别.

图3 鹌鹑蛋蛋壳垂直晶体层横截面的扫描电子显微镜照片（a1）（a2） 深褐色区域（Bar=1 μm，300 nm），（b1）（b2）浅黄色区域（Bar=1 μm，300 nm）Fig.3 SEM images of cross sections of vertical crystal layer in quail eggshell(a1) (a2) dark brown area of quail eggshell, (b1) (b2) light yellow area of quail eggshell

2.1.3 海绵层

海绵层中具有大量孔洞（如图4所示），平均空隙直径约为500 nm，孔洞内表面布满纳米级的颗粒突起.深褐色区域[如图4（a1） （a2） （a3）所示]和浅黄色区域[如图4（b1） （b2） （b3）所示]在扫描电子显微镜下观察未见明显区别.

图4 鹌鹑蛋蛋壳海绵层横截面的扫描电子显微镜照片（a1）～（a3）深褐色区域（Bar=5 μm，1 μm，300 nm），（b1）～（b3）浅黄色区域（Bar=5 μm，1 μm，300 nm）Fig.4 SEM images of cross sections of spongy layer in quail eggshell(a1)～(a3) dark brown area of quail eggshell, (b1)～(b3) light yellow area of quail eggshell

2.1.4 乳突层及壳膜层

乳突由柱状和椎体状两部分组成（如图5所示），单层垂直排列，椎体尖端朝向蛋壳内部的壳膜层.壳膜层由纤维组成，与蛋壳表面平行，乳突层的尖端突起和壳膜纤维交错层叠.

图5 鹌鹑蛋蛋壳乳突层横截面的扫描电子显微镜照片Fig.5 SEM image of cross section of mastoid layer in quail eggshell (Bar=20 μm)

2.2 鹌鹑蛋蛋壳外表面的扫描电子显微镜观察

对鹌鹑蛋蛋壳外表面进行观察，可见布满裂纹[如图6（a）所示]，深褐色区域[图6（a）左侧]较浅黄色区域[图6（a）右侧]皲裂块体大，裂纹缝隙大.深褐色区域皲裂块体表面致密平滑[如图6（b）所示]，浅黄色区域可见纳米和微米级的圆形突起[如图6（c）所示].

图6 鹌鹑蛋蛋壳外表面的扫描电子显微镜照片（a）深褐色区域和浅黄色区域交界处，左侧为深褐色，右侧为浅黄色（Bar=100 μm），（b）深褐色区域（Bar=2 μm），（c）浅黄色区域（Bar=2 μm）Fig.6 SEM images of outer surface of quail eggshell(a) junction of dark brown area and light yellow area, dark brown area on left side and light yellow area on right side,(b) dark brown area of quail eggshell, (c) light yellow area of quail eggshell

将鹌鹑蛋蛋壳外表面深褐色和浅黄色都擦去，呈现乳白色，在扫描电子显微镜下观察，可见擦去颜色后的表面有零星小孔[如图7（a） （b）所示]，孔径约10～30 μm.

图7 擦去颜色后鹌鹑蛋蛋壳外表面小孔的扫描电子显微镜照片Fig.7 SEM images of pores on outer surface of quail eggshell after wiping off color (Bar=10 μm)

2.3 内表面的扫描电子显微镜观察

对未撕去内膜的内表面观察，其结构致密粗糙，可见纤维状以及颗粒状的纹路[如图8（a1） （a2）（a3）所示].内膜撕去后，可见纤维交织层叠，纤维粗细约为1～2 μm，突出的颗粒状镶嵌在纤维上，颗粒大小约为15 μm [如图8（b1） （b2） （b3）所示].

图8 鹌鹑蛋蛋壳内表面的扫描电子显微镜照片（a1）～（a3）蛋壳内膜的内表面（Bar=100 μm，10 μm，2 μm），（b1）～（b3） 已撕去内膜的内表面（Bar=100 μm，20 μm，3 μm）Fig.8 SEM images of inner surfaces of quail eggshell(a1)～(a3) inner surface of shell-membrane, (b1)～(b3) inner surface of quail eggshell after peeling off shell-membrane

2.4 能谱分析

表1和图9、10的能谱结果表明，蛋壳主要组成元素为Ca、O、C、N、P和S.其中角质层和壳膜层以C和O为主.角质层的C、O元素分别占总质量分数的30.17%、35.54%，壳膜层的C、O元素分别占总质量分数的48.47%、26.06%.垂直晶体层、海绵层和乳突层以Ca和O为主.垂直晶体层的Ca、O元素分别占总质量分数的33.08%、47.02%，海绵层的Ca、O元素分别占总质量分数的37.16%、47.24%，乳突层的Ca、O元素分别占总质量分数的44.06%、33.85%.

图9 蛋壳横截面能谱线扫描结果Fig.9 EDS line scan results of cross sections of eggshell

深褐色和浅黄色交界区域的热度图如图11所示，深褐色和浅黄色区域的元素含量结果如表2所列.由图11和表2可见，深褐色区域的C、O和N元素质量分数相对高于浅黄色区域，浅黄色区域的Mg、P、S和Ca元素质量分数相对高于深褐色区域.

图11 鹌鹑蛋蛋壳外表面的扫描电子显微镜、能谱结果热度图（Bar=800 μm）Fig.11 Heat maps of elements of outer surface of quail eggshell (Bar=800 μm)

3 结论

蛋壳是一种复杂多孔有序的生物陶瓷材料，是在输卵管内不同阶段由不同材料连续沉积形成，主要含碳酸钙（方解石多晶型物）以及蛋白质和多糖[13].蛋壳的结构从内部到外部一般可观察到6个不同的层.内层是壳膜，是双层的纤维状聚合物构成，纤维交织成网状，网上有结节，壳膜可作为抵御病原体入侵的物理和化学屏障[14].乳突层由钙化的柱体和锥体组成，锥体尖端插入壳膜层，和壳膜层的纤维相缠绕.海绵层占蛋壳厚度的一半以上，对蛋壳的坚实程度有重要影响.海绵层的晶体紧密结合，内有大量孔隙.海绵层延伸到垂直晶体层，垂直晶体层由垂直于外壳表面排列的晶体组成.最外层是角质层，在角质层中，含有大量蛋壳色素，盖在角质层内部的羟基磷灰石晶体上[15].角质层覆盖外壳并堵塞孔道，从而防止微生物渗透[16]，外表呈现皲裂状态，裂缝可起到气体交换的作用.

表 1 鹌鹑蛋蛋壳各层的能谱结果Table 1 EDS of different layers of quail eggshell

通过扫描电子显微镜对鹌鹑蛋蛋壳内表面、外表面、横截面的观察，得出以下几点结论：（1）鹌鹑蛋蛋壳上的深褐色区域比浅黄色区域厚约10 μm，厚度差异来自于角质层.（2）蛋壳有层次结构，含有大量纳米和微米级的球体颗、棒状体、纤维，以及组成的纳米和微米级的孔隙.（3）深褐色区域的C、O和N元素含量相对高于浅黄色区域，浅黄色区域的Mg、P、S和Ca元素含量相对高于深褐色区域.可能是深褐色区域较浅黄色区域的表层沉积了更多的蛋壳腺上皮细胞分泌的原卟啉、胆绿素及其锌螯合物等色素物质，从而呈现出更深的颜色.

图10 蛋壳横截面能谱面分布结果（Bar=100 μm）Fig.10 EDS mapping of cross section of eggshell (Bar=100 μm)

表 2 深褐色区域和浅黄色区域的能谱结果Table 2 EDS of different areas