核酸适配体可视化检测养殖水样品中的孔雀石绿

李 娜，袁 聪，张秋双，王小艳

(河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450011)

孔雀石绿是一种具有毒性的三苯甲烷类染料，能够有效地抑制和杀灭真菌、寄生虫和细菌[1,2]。孔雀石绿为翠绿色、带强烈光泽的固态结晶物，其在水溶液中可以清晰地显示淡淡的蓝绿色[3-5]。孔雀石绿毒性高[6]，孔雀石绿中毒导致鱼类的腮、皮肤表面和消化道发炎，并且能够阻止肠道酶的分泌[7-9]，还可以致畸、致癌、致突变，被归入二类致癌物[10-14]。

目前，国内外检测孔雀石绿的方法主要有分光光度法[15-17]、色谱法[18,19]、电化学法[20,21]、酶联免疫吸附法[22,23]、生物传感器法[24]等。虽然这些方法可以有效地测定样品中孔雀石绿含量，但这些方法前处理及操作过程复杂，需用专门的仪器设备，对人员技术要求高，测定成本高，从而限制了这些方法的广泛应用。

核酸适配体和纳米金之间具有一定的亲和力，能将纳米金吸附到其表面从而改变纳米金的聚集状态，进而产生颜色反应[25]，本试验基于纳米金颗粒颜色变化机理，选用核酸适配体作为生物识别元件，构建一种灵敏度高、特异性强的可视化快速检测孔雀石绿的方法。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

孔雀石绿购自国康生物科技有限公司。柠檬酸钠购自西安拉维亚生物科技有限公司。氯金酸购自上海国药集团化学试剂有限公司。核酸适配体引物序列为5′-ATTGGCACTCCACGCATAGGGACGCGAATAGCGGACCYATGTGTGGTGTGTTACGGCGAGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计购自上海元析仪器有限公司；酶标板恒温振荡器购自海门市其林贝尔仪器有限公司；数控超声波清洗器和集热式恒温加热磁力搅拌器购自上海重逢科学仪器有限公司；电子分析天平(AE224)购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；旋涡混匀器(VORTEX 06)购自上海达姆实业有限公司；超纯水仪购自深圳市莱克智能精密仪器有限公司；微量高速冷冻离心机购自四川蜀科仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纳米金的合成

纳米金的合成材料是1%氯金酸和1%柠檬酸钠溶液，纳米金的合成按照Lee 等[25]的方法进行。

1.3.2 孔雀石绿的检测

首先配置不同浓度的孔雀石绿溶液，将20 μL的1 μmol/L DNA适配体和10 μL 的2 μmol/L MG溶液依次加入到96孔板中，充分振荡混合10 min，然后加入50 μL的 5 μmol/L纳米金溶液，反应5 min，再加入3 μL的1.5 mol/L NaCl溶液，继续振荡10 min，然后用紫外分光光度计分别测650 nm和520 nm处的吸光度，吸光度比值与空白对照比值相减得吸光度差值(A650/A520)。绘制吸光度差值与孔雀石绿之间的相关性曲线。

1.3.3 特异性

选择阳性对照物盐酸四环素、盐酸金霉素、土霉素、四环素、磺胺二甲嘧啶进行检测方法的选择性研究。体系中孔雀石绿和其他药物的浓度均为0.1 μmol/L。设置一个空白对照孔。测得650 nm和520 nm处的吸光度，记录溶液的颜色，吸光度比值与空白对照比值相减后得吸光度差值(A650/A520)，记录吸光度差值的变化并绘制成图。

1.3.4 样品的加标回收

取养殖水样，经0.22 μm滤膜过滤以去除杂质，然后取1 mL水样加入不同浓度的孔雀石绿(0.1、0.3和0.5 μmol/L)进行加标回收试验。

2 结果与分析

2.1 可视化检测孔雀石绿的原理

表面带有柠檬酸的纳米金颗粒之间相互排斥，颗粒分散在溶液中。当溶液体系中只有纳米金和适配体时，适配体会包含在纳米金外围而起到保护纳米金的作用，此时向溶液中加入盐溶液，由于适配体的保护作用，溶液的颜色不变，仍为红色。当加入靶标后，适配体与靶标结合，使得纳米金裸露而与盐溶液发生反应，此时纳米金颗粒在高浓度的盐环境中均匀分散，溶液的颜色向蓝紫色转变。

2.2 紫外吸收光谱表征

采用紫外分光光度计快速检测孔雀石绿方法的可行性(见图1)。当体系中只有纳米金时，溶液呈现酒红色(曲线a)；当溶液中加入盐溶液时，盐会与纳米金发生反应而溶液呈现出浅蓝色(曲线b)；同时存在纳米金和适配体时，适配体会与纳米金结合，起到保护纳米金的作用，溶液不变色(曲线c)；向溶液中加入一定量的盐时，由于盐的作用会使得适配体不再完全保护纳米金(曲线d)；而当整个体系加入目标物孔雀石绿后，会使得盐脱离出来继而和纳米金反应，使得溶液变成浅蓝色(曲线e)，吸收峰发生偏移。曲线f是只有目标物时的吸光度，当只有孔雀石绿时，溶液体系吸光度趋近于0，验证了目标物对整个体系没有影响。

图1 不同条件下反应溶液的吸收光图谱

2.3 试验条件的优化

2.3.1 体积比例

考察了不同体积(25、50、75和100 μL)纳米金溶液的吸光度值变化和颜色变化(图2)。结果表明，纳米金溶液体积为25 μL时，溶液接近无色，当纳米金溶液为50 μL时，溶液呈浅蓝色，而当纳米金溶液体积超过75 μL时，体系呈现出纳米金的红色，整个体系基本没有变化，说明纳米金的用量过多。纳米金溶液体积选择50 μL为宜。

图2 纳米金溶液体积对吸光度值差的影响

2.3.2 氯化钠体积的优化

氯化钠的体积影响纳米金颗粒的聚集。考察了不同体积(1、2、3、4、5 μL)氯化钠溶液的吸光度值变化和颜色变化(图3)，结果显示，加入的氯化钠越多，纳米金颗粒变成蓝紫色越容易。当加入氯化钠的量少于3 μL时，溶液颜色会由酒红色变成浅蓝色。但当加入氯化钠的量大于3 μL时，溶液就会很快变成蓝紫色。因此，氯化钠溶液的体积选择为3 μL。

图3 氯化钠体积对吸光度差值的影响

2.3.3 反应时间

反应时间不同(10、20、30、40和50 min)，则吸光度差值不同(见图4)。整个体系在酶标板恒温振荡器中(37℃)发生反应，随着反应时间的增加，吸光度差值呈现逐步下降的趋势。当反应时间超过10 min时，96孔板中会产生少量气泡，导致测量不准确，故本试验选择10 min为最佳反应时间。

图4 反应时间对吸光度差值的影响

2.4 可视化的性能研究

2.4.1 孔雀石绿标准曲线的建立

在优化的试验条件下，对不同浓度孔雀石绿进行测试。随着孔雀石绿浓度的不断增高，溶液吸光度的差值不断增加，溶液颜色依次变浅。以A650 nm和A520 nm处的差值为纵坐标(△A650/A520)，以孔雀石绿的浓度为横坐标，平行测定3次，绘制相关性曲线，如图5所示，线性方程为y=0.09936x+0.01098，R2=0.95098，检出限(LOD)为0.09082 nmol/L。

a-g表示加入的孔雀石的浓度依次为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L

2.4.2 特异性试验

选择盐酸四环素、土霉素、盐酸金霉素、多四环素和磺胺二甲嘧啶对所建方法的特异性进行评价。四环素、土霉素、盐酸金霉素、多四环素为混标，记作兽药。如图6所示，当孔雀石绿存在时，适配体会与其特异性结合，使得纳米金失去适配体保护而与盐发生反应，此时的溶液颜色为浅蓝色，吸光度差值变化较大，而其他干扰物质存在时，则变化较小，说明方法的特异性较好，同时也说明适配体对孔雀石绿具有高特异性。

图6 可视化检测孔雀石绿方法特异性

2.4.3 试验样品测定结果

本试验在实际样品中应用的准确性和可行性如表1所示，孔雀石绿的回收率为93.3%～116.0%，表明所建方法准确。

表1 养殖水样品中孔雀石绿的检测

3 结论

检测的最佳条件为纳米金溶液50 μL、纳米金颗粒聚集的诱导物氯化钠(1 mol/L)溶液3 μL、核酸适配体1 mol/L。在最佳试验条件下，孔雀石绿快速定量标准曲线的线性方程为y=0.09936x+0.01098，R2=0.95098，检出限为0.09082 nmol/L。加标回收率是93.3%～116.0%，相对标准偏差小于10%。