基于Micro-CT分析补肾方干预骨质疏松症大鼠模型的疗效

曾思良，潘 欣

1上海师范大学天华学院康复治疗学系，上海 201815；2同济大学附属东方医院再生医学研究所，上海 200123

骨质疏松是一种进展性的以破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨生成之间失衡为特征的全身骨代谢障碍性疾病，近年来，抑制骨吸收、刺激骨生成的两大策略构成了抗骨质疏松、恢复骨吸收与骨生成动态平衡的理论基础［1］。临床上抑制骨吸收类药物主要有雌激素、双磷酸盐类等，长期使用雌激素会引起多种并发症而受限［2］；双磷酸盐类会增加食道溃疡的发生，使用也受限［3］。甲状旁腺素类似物是促进骨形成的药物，持续应用会引起骨吸收增加的风险［4］。因此，迫切需要从天然资源中获得高效低毒的新型候选药物来治疗骨质疏松症。

中医药治疗骨质疏松的方剂药物种类繁多，针对中医对骨质疏松证候肾虚血瘀的描述，我们采用熟地黄、牛膝、龟板胶、鹿角胶、山药、山茱萸、枸杞子、菟丝子、淫羊藿和女贞子等10味药配伍补肾方中药汤剂［5］。我们前期采用补肾方大鼠灌胃血清干预大鼠成骨细胞，可观察到与骨形成信号通路相关调控信号高表达［6］；干预大鼠骨髓间充质干细胞，可降低其成脂分化［7］。本研究拟进一步采用Micro-CT技术对补肾方干预的骨质疏松动物模型的骨骼标本进行体视学观察。

Micro-CT是一种成熟的研究小动物骨骼和血管形态学的可视化方法［8］。Micro-CT将Ⅹ射线和计算机技术相结合，基于肌体不同组织成分对Ⅹ射线的不同吸收，产生机体的水平或轴向图像，具有空间分辨率高、图像采集时间短和整体成像能力强的优点［9］。骨基质中存在羟基磷灰石，是一种不透光的结缔组织，在骨组织形态计量学中，动物骨骼可以在没有脱钙的情况下，Micro-CT可直接对矿化骨组织进行非破坏性的三维微结构研究［10］。血管属于软组织，对比度相对较低，必须使用造影剂来增强对比度，区分血管与周围软组织。Microfil是一种含有铬酸铅和硫酸铅颗粒的可在血管系统中聚合的低粘度造影剂，可以充填血管网动脉侧和静脉侧的毛细血管［11］。骨组织周围血管化的形态学分析不仅对描述血管和骨组织之间的解剖和生理关系很重要，而且对理解影响骨微结构的许多病理条件发生的结构改变也很重要。既往有关中药方治疗骨质疏松的研究，多单独使用Micro-CT研究骨微结构，或单独使用Micro-CT分析骨内血管以探究其效能［12-13］。对于药物设计中提及的健骨化瘀未给出直接的可视化数据，且暂无将骨组织周围血管化的形态学分析纳入分析评价的研究。本研究尝试将骨微结构与骨周围血管造影相结合，用影像学技术评价补肾方的药效，探究补肾方活血化瘀通络壮骨的缘由，为补肾方用于临床治疗骨质疏松症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12周龄雌性SD清洁级大鼠30只（中国科学院上海生命科学研究院动物实验中心提供，许可证号：SYⅩK（沪）2018-0007），体质量250～300 g。按啮齿类动物标准饲料饲养于同济大学动物实验中心清洁级鼠房，分笼饲养。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2 药物与试剂

补肾方药由熟地黄、菟丝子、牛膝、龟板胶、鹿角胶、山药、山茱萸、枸杞子、淫羊藿和女贞子等药物组成。注射用0.9%NaCl溶液（天津百特医疗用品有限公司），戊酸雌二醇（拜耳医药保健有限公司广州分公司），碱性磷酸酶检测试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）。Microfil（Flow Tech）。

1.3 仪器

小动物Ⅹ射线计算机断层成像Micro-CT 系统（Bruker，SkyScan 1176），小动物骨骼强度测定仪(济南益延科技发展有限公司，YLS-16A），多功能酶标仪（Thermo，Varioskan Flash）。

1.4 动物分组及处理方法

12周龄雌性SD大鼠30只按随机数字表法随机分为3组，即生理盐水对照组、补肾方干预组和戊酸雌二醇干预组，10只/组。造模方法采用咪达唑仑5 mg/kg加芬太尼0.05 mg/kg尾静脉注射麻醉［14］。剃除大鼠背部两腰侧毛，用碘伏消毒大鼠术野皮肤，无菌操作下，腰侧入路进入，分离暴露卵巢，摘除卵巢，缝合。同法摘除另一侧卵巢。术中及术后过程中无死亡。造模OVⅩ大鼠继续饲养12周后，备用。

根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率表计算戊酸雌二醇、补肾方剂临床等效剂量［15］。按60 kg成人30 mL/d、每日1剂补肾方换算，大鼠等效用药剂量为每100 g大鼠体质量0.27 mL，按照等倍于临床等效剂量的标准将补肾方中药煎煮至所需体积的溶液。戊酸雌二醇按照按60 kg成人1 mg/d、1片/d换算，大鼠等效用药剂量为每100 g大鼠体质量0.01 mg，依等倍于临床等效剂量的标准将戊酸雌二醇片剂溶解悬浮于所需体积的注射用0.9%NaCl溶液中。连续30 d分别给予临床等效剂量的戊酸雌二醇、补肾方灌胃，对照组灌服等体积注射用0.9%NaCl溶液。每只OVⅩ大鼠每日定时灌胃1次，3 mL/次，第30天给药1 h后心脏取血。以3000 r/min离心15 min，分离血清，56 ℃水浴灭活30 min，血清经0.2 μm滤器过滤，置-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 检测指标

1.5.1 Micro-CT股骨骨微结构分析 动物心脏取血处死，分离后肢股骨，置70%乙醇固定1周，用0.9%NaCl溶液浸泡过夜后行Micro-CT扫描，分辨率18 μm，电压65 kV，电流0.36 mA，滤光片0.5 mm Al。股骨扫描，从较低的生长板开始18 μm延伸1900层。重建三维结构和形态学测量，采用CTAn和CTVox软件系统分析。三维形态参数包括骨密度（mg HA/mm3）、骨体积分数（%）、骨小梁数目（mm-1）、骨小梁厚度（mm）、骨小梁间隙（mm）和结构模型指数等。形态学分析参数取值范围从生长板完全暴露为第1层开始延伸到110层。

1.5.2 骨力学分析 采用YLS-16A小动物骨骼强度测定仪测定大鼠股骨的骨折应力（股骨最大荷载）和压碎力（骨结构强度）［16］。

1.5.3 血清碱性磷酸酶分析 采用对硝基苯磷酸二钠基质动力学法测定大鼠血清碱性磷酸酶［17］。

1.5.4 Micro-CT股骨周围血管分布分析 为进一步探究补肾方活血化瘀、通络壮骨的缘由，我们采用Microfil对大鼠全身进行了灌注。Microfil按说明书配置。含肝素（5 U/mL）的PBS缓冲液置37 ℃水浴锅中预热。将输液管固定在蠕动泵中，一端置于PBS液面下，另一端接上24 G留置针头，打开蠕动泵，使液体充盈管道。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉（30 mg/kg）后，暴露心脏，将连接灌流液的24 G留置针插入左心室，打开蠕动泵电源，在右心房上做一切口以排出液体，开始全身灌流，流速2 mL/min，至各主要脏器不见血色。输液管游离端置于Microfil 液面下，以0.25 mL/min 的流速灌注Microfil，至肠和腹壁上的血管充满黄色Microfil，右心房排出黄色Microfil约5 mL时，关闭蠕动泵。结扎心脏主要血管，拔出针头，将大鼠全身侵入4%多聚甲醛中室温静置约4 h，待Microfil固化，转入4 ℃过夜使其进一步固化。次日取下腿部样本（完整的胫骨、股骨及其骨骼肌），置于SkyScan 1176 micro-CT（Bruker，Kontich，Begium）中，扫描参数：分辨率18 μm，电压70 kV，电流200 μA，180°旋转，旋转步长0.4°，滤光片0.5 mm Al，binning 为2016×1344。扫描完成后，GPU NRecon Server(local)V1.7.4.2软件对micro-CT扫描图像进行结构重建，采用CT vox Version 3.3.1得到股骨周围血管分布的Micro-CT三维图像。

1.6 统计学分析

采用SAS JMP 16软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间的差异行单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism7软件进行绘图。

2 结果

2.1 大鼠股骨骨微结构的Micro-CT观察

使用Micro-CT成像技术分析7月龄OVⅩ大鼠股骨骨量和骨微结构变化。分别选取注射用0.9%NaCl溶液干预对照组、补肾方干预组和戊酸雌二醇干预组距生长板第60层至第110层的50层横切截面进行三维可视化重建，结果显示补肾方干预组骨小梁结构明显优于其他两组（图1）。

分别从各组第1 层开始延伸到110 层进行三维重建，计算骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁间隙和结构模型指数（图2）。补肾方干预组的骨密度是对照组的1.36倍（P=0.0114），是戊酸雌二醇干预组的1.21倍（P=0.0501）。补肾方干预组的骨体积分数是对照组的2.92倍（P=0.0006），是戊酸雌二醇干预组的1.71倍（P=0.0063）。补肾方干预组的骨小梁数目是对照组的2.55倍（P=0.0016），是戊酸雌二醇干预组的1.52倍（P=0.022）。补肾方干预组的骨小梁厚度是对照组的1.15倍（P=0.005），是戊酸雌二醇干预组的1.13倍（P=0.0108）。补肾方干预组的骨小梁间隙是对照组的0.95 倍（P=0.5234），是戊酸雌二醇干预组的0.94 倍（P=0.4154）。补肾方干预组的结构模型指数是对照组的1.04倍（P=0.0551），是戊酸雌二醇干预组的1.06倍（P=0.0112）。

2.2 大鼠股骨骨力学检测

补肾方干预组的股骨骨折应力是对照组的1.48倍（P=0.0044），是戊酸雌二醇干预组的1.21倍（P=0.0555）；补肾方干预组的压碎力是对照组的1.07倍（P=0.4187），是戊酸雌二醇干预组的1.05倍（P=0.5435，图3）。

2.3 血清碱性磷酸酶活性检测

补肾方干预组的血清碱性磷酸酶活性是对照组的1.86倍（P=0.0014），是戊酸雌二醇干预组的1.66倍（P=0.003，图4）。

2.4 大鼠股骨周围血管分布Micro-CT观察

使用Micro-CT成像技术分析7月龄OVⅩ大鼠腿骨（完整的胫骨、股骨及其骨骼肌）周围的血管分布（Microfil造影剂灌注血管），结果显示补肾方干预组营养动脉及其分支显示良好，股骨周围血管体量明显高于其他两组。补肾方干预组的血管体积是对照组的2.28倍（P＜0.0001），是戊酸雌二醇干预组的1.89 倍（P=0.0002，图5）。

3 讨论

中医药在防治骨质疏松症方面历史悠久，在中医“川肾藏精，主骨生髓”理论指导下，根据“血瘀”、“肾虚”症候，我们采用熟地黄、菟丝子、牛膝、龟板胶、鹿角胶、山药、山茱萸、枸杞子、淫羊藿和女贞子等10味药配伍了补肾方中药汤剂。补肾方中的熟地黄为活血祛瘀类中药，在临床治疗骨质疏松症验方中高频出现，梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D为其主要有效成分［18］。牛膝活血通经，其总皂苷、脱皮甾酮可促进成骨细胞增殖［19］。龟板胶主要成分为骨原胶，长于滋补肝肾之阴，具有显著填精补髓之功，可促进骨髓间充质干细胞增殖［20］。鹿角胶生精补髓，养血益阳，强筋健骨,散寒止痛［21］。淫羊藿为补骨壮阳中药,可抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化，其黄酮类植物雌激素成分（如淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷、淫羊藿甙均可促进骨形成，减少骨吸收）是淫羊藿发挥抗骨质疏松药理作用的主要有效成分。女贞子具有扶正固本、滋补肝肾、明目乌发之功效，100多种化合物中萜类（如齐墩果酸、熊果酸）、黄酮类是抗骨质疏松作用的主要成分［22］。山药中的薯蓣皂甙元有利于成骨细胞的增殖和分化［23］。山茱萸为滋阴益肾中药，山茱萸总苷可有效抑制骨丢失，保存骨量［24］。枸杞子滋补肝肾，益精明目，枸杞多糖为其主要活性成分［25］。菟丝子温肾益精，养肝明目，菟丝子黄酮为其主要有效成分，可抑制骨量丢失，改善骨密度［26］。由于补肾方成分复杂多样，其改善骨质疏松症候的确切疗效需要尽快做出整体评价。

骨质疏松症是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病［27］。Micro-CT技术是一种无创性、安全的检测手段，在很大程度上取代了破坏性的骨组织形态计量学方法，广泛应用于骨组织微结构研究［12］。本研究结果提示，与对照组相比，OVⅩ大鼠经补肾方干预4周后，Micro-CT分析显示股骨骨微结构明显改善，骨骼强度检测显示股骨骨折应力（股骨最大荷载）明显加强，压碎力（骨结构强度）有向好趋势，血清碱性磷酸酶活性明显升高。

在成年期，骨重塑和骨组织的血液供应紧密相关，二者被相同的细胞因子和生长因子所调控［28］。骨组织血管化的缺乏伴随着骨形成的减少和骨质量的下降［29］，有研究证实，绝经后骨质疏松是由于骨组织内血管系统功能障碍所引起，骨质疏松病患的骨组织血液灌注明显低于正常人［30］。目前，利用Microfil为造影剂研究的动物骨内血管多采用灌注后脱钙方法［13,31］，未见关注骨周围附着肌肉的血管分布。为探寻补肾方在改善“血瘀”方面的效应，我们在完成Microfil造影剂对OVⅩ大鼠全身微血管铸型后，未经脱钙，并在保留腿部肌肉组织的条件下进行了Micro-CT扫描，结果显示补肾方干预组腿骨周围血管数量明显增多，营养动脉及其分支充盈显示良好；生理盐水和戊酸雌二醇干预组营养动脉分支多数消失，提示血管分支发生阻塞，在同等灌注条件下Microfil难以通过阻塞的血管分支形成影像。推测补肾方可能通过改善腿部血瘀，提高骨骼肌肉营养，达到改善骨质疏松的目的。

综上所述，骨微结构分析联合骨周围血管造影分析可判断中药方剂是否具备健骨化瘀功效，两者联合的micro-CT分析效果可提高骨质疏松治疗药物的药效判别率，为药物进入临床应用提供更为直观可靠的实验依据。