重复6 h时差处理对小鼠行为节律影响

李 琼， 马 常 啸， 陈 丽 红， 杨 光 锐*

(1.大连理工大学 生物工程学院，辽宁 大连 116024；2.大连医科大学 医学科学研究院，辽宁 大连 116044)

0 引 言

生物钟是生命活动的内在节律，是生物体对周期性变化的环境，尤其是昼夜变化所做出的适应性反应.光作为最重要的授时因子在调节体内时钟，以使其与外界环境相适应中起着至关重要的作用[1].当发生昼夜紊乱时，体内时钟与外界时钟不同步，可能引起一定的时差反应[2].尽管时差现象在自然界中并不常见，但随着科技的飞速发展，现代社会已有很多人受到时差、熬夜、昼夜颠倒等生物钟紊乱的影响.

小鼠作为最重要的哺乳类模式生物，广泛应用于时差等生物钟紊乱的研究.有实验表明，不同品系小鼠的行为节律，包括自由运动周期(free running period，FRP)[3]、调整时差的速度等具有显著的差异.比如，BALB/c小鼠的FRP明显短于C57BL/6小鼠[3-4]；同时，BALB/c小鼠调整时差的速度总体上快于C57BL/6小鼠[5-7].即使同一品系的小鼠，在不同的实验环境中，甚至在同一实验中也存在一定的个体差异.有证据显示，面对单次向前6 h时差(+6，即相当于向东跨越6个时区)处理，C57BL/6小鼠需要4～9 d不等的时间去调整自身的行为节律[8-10].另外，时差的方向对机体的适应能力以及健康也有不同的影响，人群样本研究表明，向东飞行产生的时差比向西飞行更有损健康[11].小鼠也有类似的情况，据报道，长期暴露于频繁的提前时差(相当于向东跨时区旅行)干扰下的老年小鼠的寿命显著短于延迟时差组的同龄小鼠[12].

尽管人们早就知道长期生物钟紊乱有损健康，对小鼠也有大量关于生物钟紊乱降低机体免疫力，诱发或加重心血管疾病、代谢性疾病、神经退行性病变等众多慢性重大疾病的报道[13]，但到目前为止，偶发时差对正常小鼠健康的影响还知之甚少，主要原因是单次或数次时差处理仍然是比较弱的有害刺激，也鲜有足够敏感的检测轻微生物钟紊乱的客观指标.另外，短期内数次重复的时差是否会在一定程度上提高小鼠调整生物钟的能力也尚不清楚.为此本文给予C57BL/6小鼠多次向前6 h时差或向后6 h时差(-6，即相当于向西跨越6个时区)处理，利用跑轮活动数据计算出小鼠调整每一次时差所需时间，以了解小鼠适应能力的动态变化.

1 材料和方法

1.1 实验动物

6周龄雄性C57BL/6小鼠(长生生物技术有限公司，辽宁本溪)饲养于配有跑轮的鼠笼，每笼一只，所有鼠笼均放置于灯光可控的通风柜中(普百康科技发展有限公司，湖北武汉)，小鼠适应2周后开始进行实验.实验前及实验的全过程，小鼠自由饮水和摄食.除时差处理外，小鼠均处于正常昼夜环境中(12 h光照/12 h黑暗)，开灯时，光亮度在跑轮最低点的层面大约为100 lx.

该动物研究得到了大连理工大学动物保护与使用委员会的审查和批准.

1.2 跑轮活动

使用ClockLab软件(Actimetrics，美国)记录小鼠在实验全过程跑轮活动的情况，每10 min记录一次.小鼠每天活动的起始点定义为该天第一个活动数大于或者等于当天活动峰值数的10%，并且在之后的连续6个活动数中至少有3个满足这一条件[9]；每天活动结束点的定义与之相反，即最后一个活动数小于或者等于峰值数的10%，并且在之前的6个活动数中至少有3个满足这一条件[14-15].经历时差时，行为节律与新光暗周期重新同步化定义为当天活动起始点或结束点与时差前一天活动起始点或结束点相差小于0.5 h[14].由于掩蔽效应的存在，向前时差重新同步化的天数以活动起始点的时间来计算，向后时差的同步根据活动结束点来计算[16].用小鼠活动开始(或结束)的时间点与实际关灯(或开灯)时间点的差值即相位角(θ)来表示小鼠的行为节律在当前光暗周期下的适应和稳定程度，其中正值表示时差提前，负值表示时差延迟[9].

1.3 时差计划

小鼠饲养2周后随机分为A、B两组(每组7只).A组小鼠先经历4次+6时差，随后经历3次-6时差(分别命名为A1～A4，A′1～A′3).B组小鼠先经历3次-6时差，随后经历2次+6时差(分别命名为B1～B3，B′1～B′2).相邻时差间隔的天数大于等于每组中调整时差最慢的小鼠同步所需要的天数.

1.4 统计学分析

利用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，所有数据都采取双尾检验.两组数据之间比较使用t检验；多组数据间的比较利用单因素方差分析和双因素方差分析，结合Tukey检验.所有柱图结果用均值±标准误差表示.p<0.05表示有统计学差异.

2 结果分析

2.1 先+6时差后-6时差处理对小鼠行为节律的影响

在A组时差模型中，小鼠先经历4次+6时差(图1(a)，圆点代表小鼠活动的开始点，红色箭头代表该小鼠行为节律在这一天重新适应)，随着时差次数的增加，相位角的最大值有逐渐降低的趋势(图1(b)，黄色箭头代表光暗周期发生了相移).小鼠调整时差所需的时间分别为(5.33±0.21)d、(4.29±0.40)d、(2.57±0.50)d、(1.29±0.20)d(图1(c))，总体上逐渐减少(A3vs.A1，p=0.007；A4vs.A1，p<0.001；A4vs.A2，p=0.003)，尤其是最后一次+6时差后，7只小鼠中有5只几乎立刻适应了新的时间，另外2只也在2 d内调整完时差.

随后给予小鼠反向，即-6时差处理(图2(a))，并采用每天活动的结束点来分析小鼠重新适应新的光暗周期的能力(图2(b)).结果显示小鼠调整3次时差所需的时间依次为(5.71±0.61)d、(3.57±0.30)d、(2.86±0.26)d(图2(c))；其中A′2、A′3相较A′1显著缩短(A′2vs.A′1，p=0.008；A′3vs.A′1，p=0.005)，但A′2与A′3无统计学差异.

2.2 先-6时差后+6时差处理对小鼠行为节律的影响

在B组时差模型中，小鼠先经历3次-6时差(图3(a))，随着时差次数的增加，相位角的最大值有下降趋势(图3(b))，小鼠调整3次时差所需的时间分别为(5.83±0.40)d、(4.67±0.33)d、(3.00±0.36)d(图3(c)).其中，B3与B1、B2相比缩短的趋势具有显著性差异(B3vs.B1，p=0.012；B3vs.B2，p=0.024).

随后给予小鼠两次+6时差处理(图4(a))，两次时差间的相位角的最大值基本相同(图4(b))，但调整时差所需的时间具有显著性差异[B′1，(13.17±0.65)d；B′2，(8.83±0.65)d，p=0.007](图4(c)).

2.3 反向时差对小鼠行为节律的影响

A、B两组小鼠在第一阶段单向时差处理过程中，调整行为节律的速度逐步提高，且提高的程度相近.然而，在第二阶段，即经历反向时差时，两组小鼠的行为表现出显著的差异(图5(a)、(b)).A组小鼠先经历+6时差再经历-6时差，两个阶段的第一次时差所需的调整时间无统计学差异(A1vs.A′1，p=0.779)，但是B组小鼠调整第一次反向时差需要花费大约13 d，大大超出调整B1时差所需的时间(p<0.001)，也超出A组第一次反向时差所需的调整时间(p<0.001，图5(c)).

3 结果讨论

大量流行病学调查结果显示，长期生物钟紊乱与心血管疾病[17]、代谢性疾病[18]、肿瘤[19]、神经退行性病变[20]等众多人类常见重大慢性疾病的发生发展相关[21].动物实验研究也证实了它们之间的因果关系.然而，在经历一次或少数几次昼夜紊乱干扰之后，尽管机体会产生一定程度的时差反应，但并没有可靠的证据表明会导致器质性病变的发生，为研究短时间内进行数次时差处理是否可以提高机体调整生物钟或倒时差的能力，记录了C57BL/6小鼠在多次+6和-6时差中的跑轮活动情况，并计算了每次调整时差所需时间，以大致反映不同次数时差间小鼠适应能力的差别.首先，与预期的一样，两组小鼠在分别经历第一次+6和-6时差时，行为节律重新与光暗周期同步化所需要的时间基本相同，这也与先前的报道一致[9]，说明尽管两个方向的时差对机体健康的影响不同[12]，但行为学上两组小鼠调整时差所需的时间基本一致.在接下来重复同向的时差过程中，无论是正向时差或是反向时差，小鼠行为节律重新与光暗周期同步化所需要的时间都有所减少，这表明至少在行为学上，对于6 h的时差来说，小鼠调整生物钟的能力随着时差次数增加而增强.

随后，给予两组小鼠反向时差处理，即先前经历+6时差的小鼠行-6时差处理，反之亦然.结果显示先经历+6时差的小鼠，在经历第一次反向时差，即-6时差时，调整行为节律所需的时间并未进一步减少，而是与初次经历+6时差时类似.在先经历-6时差，后经历+6时差的小鼠，适应第一次+6时差所需的时间竟然显著延长至13 d.这或许因为小鼠已经适应了第一阶段的单向时差，突然给予反方向的时差将变得不适应，推测如果两个阶段间隔时间足够长，将看不到这一现象；类似地，相邻的同向时差间隔时间足够长也将看不到适应性增强的情况，但间隔多久才能完全消除之前的印记，以及这些现象的分子基础是什么，都有待进一步研究.

4 结 语

本实验通过对C57BL/6小鼠进行短期数次同向的时差处理，发现无论是向前或是向后的时差，都能够逐步提高小鼠调节行为节律的能力；但随后给予反向时差时，小鼠的适应能力并不会进一步提高，还会被大大削弱.这些结果都表明小鼠调节时差的能力与时差的次数和方向的变化密切相关，也提示对于经常轮班工作，比如三班倒的人群来说，单向循环的轮班制相对健康.