葡萄籽原花青素对糖尿病牙周炎大鼠血清脂联素和牙周组织炎性状态的影响

朱晓娟，代海涛，李 艳，崔灵欣，王 亚，徐 江，仵 楠

0 引 言

牙周炎是糖尿病的重要并发症之一，与糖尿病之间存在密切的双向关系[1]。近年来，糖尿病牙周炎的治疗越来越受到重视，但目前针对糖尿病患者的牙周炎症尚缺少有效的控制手段。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins extract，GSPE)是从葡萄籽内分离出的一种富含多酚类的提取物，具有血管舒张、抗氧化、改善血管内皮功能、抗炎、降脂等作用[2-4]。近年来，越来越多的科研工作者开始关注原花青素在辅助治疗糖尿病方面的作用，但GSPE对糖尿病牙周炎是否具有保护作用目前国内外鲜少报道。为此，本研究通过建立糖尿病牙周炎大鼠模型，尝试探究GSPE对大鼠血糖、血清脂联素、TNF-α、IL-6及牙周组织炎性状态变化的影响。

1 材料与方法

1.1 分组、造模及给药6周龄雄性SD大鼠50只，体重为(210±10)g，由新疆医科大学动物中心提供[生产许可证号：SCXK(新)2018-0002]，饲养于石河子大学转化医学动物实验中心，实验室环境：温度22～26 ℃，相对湿度40%～70%。本研究中所有实验方案均得到石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准下进行动物研究(批件号：A2021-073-01)。所有大鼠适应性喂养1周后随机等分为5组，即对照组、单纯牙周炎组、糖尿病牙周炎组、单纯牙周炎GSPE干预组、糖尿病牙周炎GSPE干预组。对照组不做任何处理，正常饲料喂养。糖尿病牙周炎组和糖尿病牙周炎GSPE干预组给予高糖高脂饲料喂养，4周后腹腔注射45 mg/kg链脲佐菌素诱导糖尿病，注射3 d后取尾静脉测空腹血糖，连续3 d空腹血糖≥15 mmol/L、第7天空腹血糖≥16.7 mmol/L，则视为糖尿病模型建立成功。糖尿病建模成功1周后，除对照组外，其余4组大鼠均给予腹腔注射体积分数为10%的水合氯醛(300～350 mg/kg)麻醉，采用0.2 mm结扎丝结扎于双侧上颌第一磨牙牙颈部。建模成功标准：肉眼检査大鼠牙龈组织有充血、出血、肿胀、溢脓、溃疡和糜烂等现象，且牙龈指数≥2，即牙周炎建模成功。国际通用牙龈指数评价标准[5]：牙龈健康为0分；牙龈轻度炎症，即牙龈的颜色有轻度改变并有轻度水肿，探诊不出血为1分；牙龈有中等炎症，即牙龈色红，水肿光亮，探诊出血为2分；牙龈有严重炎症，即牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向为3分。模型建立成功后单纯牙周炎GSPE干预组、糖尿病牙周炎GSPE干预组每日定时给予GSPE 100 mg/kg灌胃，对照组、单纯牙周炎组和糖尿病牙周炎组给予等量的等渗盐水灌胃。连续给药8周后，10%水合氯醛麻醉大鼠后取腹主动脉血，血液样本3200×g离心10 min后取上清，-80 ℃保存备用。然后处死大鼠，留取上颌骨备用。

1.2主要试剂及仪器葡萄籽原花青素提取物(天津尖峰天然产物公司)，链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)(美国 Sigma 公司)，血糖仪(罗氏诊断公司)，大鼠脂联素的ELISA试剂盒(上海隆垒生物科技有限公司)，TNF-α、IL-6的ELISA试剂盒(北京晶美生物公司)

1.3检测指标与方法

1.3.1 体重及空腹血糖测定所有大鼠在给药后第2、4、6、8周测量体重，血糖检测仪测量空腹血糖值。

1.3.2牙周炎症评估牙龈指数和龈沟出血指数：采用国际通用牙龈指数[5]和龈沟出血指数评价标准对大鼠双侧上颌第一磨牙牙龈情况及龈沟出血情况记分[6]。

牙槽骨吸收高度：取右侧上颌骨，去除结扎线，4%多聚甲醛固定48 h，流水冲洗12 h后剥离表面软组织，亚甲蓝染10 min，流水冲洗去除多余亚甲蓝，晾干后用游标卡尺测量第一磨牙釉牙骨质界到牙槽嵴顶之间的距离(界嵴距)，测量位点为该牙颊侧和腭侧近中、中、远中6个位点，取均值。

牙槽骨吸收高度=该组界嵴距-对照组界嵴距

牙周组织病理学观察：取左侧上颌骨，去除结扎线，4%多聚甲醛固48 h后置于10%的乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液中常温下脱钙8周，每隔4 d换1次脱钙液，常规脱水、石蜡包埋，沿第一磨牙牙体长轴颊舌方向制作厚度为5 μm的切片，每个样本取牙周结构完整切片进行HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠牙周组织形态变化。

1.3.3血清脂肪因子与炎症因子检测按试剂盒操作流程测定血清脂联素、TNF-α、IL-6指标。

2 结 果

2.1 一般情况对照组、单纯牙周炎组和单纯牙周炎GSPE干预组大鼠一般状况良好，毛发光亮，行动敏捷，代谢正常，摄食量、饮水量及尿量均正常；糖尿病牙周炎组大鼠状况较差，精神萎靡，体型消瘦，毛发暗淡无光泽，弓背蜷体，行动较迟缓，反应迟钝，摄食量、饮水量及尿液量均有所增加。与糖尿病牙周炎组相比，糖尿病牙周炎GSPE干预组大鼠的一般状况有所改善。

2.2体重及血糖变化比较对照组、单纯牙周炎组和单纯牙周炎GSPE干预组大鼠随着正常的生长发育，体重不断增加，且组间差异无统计学意义(P>0.05)；而糖尿病牙周炎组和糖尿病牙周炎GSPE干预组大鼠体重逐渐减轻。GSPE干预8周后，糖尿病牙周炎组大鼠体重明显低于糖尿病牙周炎GSPE干预组(P=0.007)。见表1。

表1 各组大鼠体重变化比较

对照组、单纯牙周炎组和单纯牙周炎GSPE干预组大鼠血糖始终处于正常水平。糖尿病牙周炎组和糖尿病牙周炎GSPE干预组血糖明显高于对照组(P<0.05)；糖尿病牙周炎组血糖显著高于糖尿病牙周炎GSPE干预组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠各时间点血糖含量变化比较

2.3牙龈指数、龈沟出血指数、牙槽骨吸收高度比较与对照组相比，单纯牙周炎组和糖尿病牙周炎组牙龈指数、龈沟出血指数及牙槽骨吸收高度明显升高(P<0.05)；与单纯牙周炎组相比，糖尿病牙周炎组牙龈指数、龈沟出血指数及牙槽骨吸收高度明显升高(P<0.05)，单纯牙周炎GSPE干预组牙龈指数、龈沟出血指数及牙槽骨吸收高度明显降低(P<0.05)；与糖尿病牙周炎组相比，糖尿病牙周炎GSPE干预组牙龈指数、龈沟出血指数及牙槽骨吸收高度降低(P<0.05)；与单纯牙周炎GSPE干预组相比，糖尿病牙周炎GSPE干预组牙龈指数、龈沟出血指数及牙槽骨吸收高度明显升高(P<0.05)。见表3。

表3 牙周炎大鼠治疗后各项指标观察

2.4牙周组织病理检查结果对照组为正常牙周组织，牙龈上皮完整，结合上皮根方位于釉牙骨质界处，无附着丧失，结缔组织未见明显炎细胞浸润，牙槽骨未见明显吸收；单纯牙周炎组牙龈上皮糜烂，结缔组织内炎细胞浸润，结合上皮向根方增殖；糖尿病牙周炎组见大量炎性细胞浸润，结合上皮向根方增殖，牙槽骨吸收，出现明显的骨吸收陷窝；单纯牙周炎GSPE干预组和糖尿病牙周炎GSPE干预组牙龈上皮较完整，可见少量炎细胞浸润，牙周膜连续，胶原纤维出现增生，有成骨细胞和新生骨生成。见图1。

a：对照组；b：单纯牙周炎组；c：糖尿病牙周炎组；d：单纯牙周炎GSPE干预组；e：糖尿病牙周炎GSPE干预组(箭头指向釉质牙骨质界)

2.5血清脂联素、TNF-α、IL-6对照组、单纯牙周炎组和单纯牙周炎GSPE干预组血清脂联素水平差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，糖尿病牙周炎组脂联素水平显著降低(P<0.01)；与糖尿病牙周炎组相比，糖尿病牙周炎GSPE干预组脂联素水平明显升高(P<0.01)。单纯牙周炎组和糖尿病牙周炎组血清TNF-α及IL-6水平显著高于对照组(P<0.05)；糖尿病牙周炎组IL-6及TNF-α水平明显高于单纯牙周炎组(P<0.05)；单纯牙周炎GSPE干预组IL-6及TNF-α水平明显低于单纯牙周炎组(P<0.05)；糖尿病牙周炎GSPE干预组IL-6及TNF-α水平明显低于糖尿病牙周炎组(P<0.05)；糖尿病牙周炎GSPE干预组IL-6及TNF-α水平明显高于单纯牙周炎GSPE干预组(P<0.05)。见表4。

表4 GSPE对各组大鼠血清脂联素、IL-6、TNF-α的影响

3 讨 论

糖尿病是一种由多病因引起的代谢性疾病，其特征是患者的血糖长期高于标准值，机体长期高血糖状态会危及多种组织，特别是眼、肾、心血管等[7]。牙周炎是一种由菌斑引发的侵犯牙龈和牙周组织的慢性炎症，是导致成年人牙齿丧失的主要原因，严重危害患者的生活品质和口腔健康[8]。牙周炎与糖尿病的关系已经得到全球牙周病学专家共识，并特别指出糖尿病能显著影响牙周病的进程，是牙周病的重要描述因子[9]。有研究表明，糖尿病患者患牙周炎的风险是没有糖尿病的人的2～3倍[10]。牙周炎又被称为糖尿病的第六大并发症[11]。近年来，糖尿病牙周炎的治疗越来越被人们重视。GSPE因其具有良好的清除自由基、提高抗氧化能力、抗肿瘤及调节血糖血脂的作用被广泛关注[12]。有多项研究表明GSPE具有改善肥胖相关代谢并发症的能力，包括降低血压、调节血脂、改善炎症和胰岛素抵抗[13]。Yoko等[14]发现原花青素还能以剂量依赖性的方式通过口服糖耐量试验来起到抑制急性高血糖的作用。Toker等[15]研究证实，GSPE能够减少糖尿病牙周炎大鼠牙槽骨吸收，减轻牙周炎症，增加成骨细胞活性。本实验研究发现，与单纯牙周炎组相比，糖尿病牙周炎组牙周炎症更加严重，说明糖尿病会加重牙周炎发展；经GSPE干预后，单纯牙周炎GSPE干预组和糖尿病牙周炎GSPE干预组牙周炎症情况均有所改善，表明GSPE具有改善牙周炎症作用，与Toker等研究结果一致。另外，糖尿病牙周炎GSPE干预组血糖明显低于糖尿病牙周炎组，说明GSPE有降低血糖能力。研究还表明，控制血糖可明显减轻糖尿病对牙周组织的破坏，增强牙周组织的修复能力。

脂联素是一种由脂肪细胞特异性分泌的蛋白质，是目前发现的唯一与机体脂质含量呈负相关的脂肪因子，它在许多疾病的生理和病理过程中发挥着重要的负性调节作用，具有纠正血糖血脂紊乱、抗炎、胰岛素增敏、心血管保护等功能[16]。脂联素可加快吸收骨骼肌细胞糖类及脂肪酸氧化，促进胰岛素抑制糖原异生途径，调节糖脂代谢，因而提出血清脂联素水平可作为糖尿病发生的预测因子[17-18]。另外，研究发现脂联素在抑制促炎细胞因子刺激的同时也能促进抗炎介质的排放[19]。脂联素还可通过抑制活性氧表达对牙周组织起到一定的保护作用[20-21]。因此，有理由推测脂联素在糖尿病和牙周炎的发生发展中起到相互影响作用。在本研究中，单纯牙周炎组血清脂联素水平虽然较对照组降低，但是差异无统计学意义，糖尿病牙周炎组脂联素水平较对照组明显降低(P<0.05)，推测单纯牙周炎不会引起血清脂联素水平降低，但是当糖尿病合并牙周炎时是会导致血清脂联素水平降低。与糖尿病牙周炎组相比，糖尿病牙周炎GSPE干预组脂联素水平升高，说明GSPE能够升高糖尿病牙周炎大鼠血清脂联素水平，调节机体糖脂代谢。

有研究发现，TNF-α和脂联素化学结构相似，均可由脂肪细胞分泌，共用一个信号通道，均参与了机体胰岛素抵抗的发生发展过程，但发挥的作为却截然相反[22]。Aljada等[23]研究发现糖尿病患者肌肉及脂肪组织中TNF-α含量很高，推测其可能与糖尿病的发生存在着密切的关联。另外TNF-α是核因子-κB信号通路的一种促炎因子，在牙周炎症的发生发展过程中同样起着重要作用[24]。与TNF-α一样，IL-6也参与牙周炎的发生和发展[25]。研究表明IL-6可以通过增加牙周炎症组织中的基质金属蛋白-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)引起组织破坏，MMP-1在细胞外释放到牙周炎症组织中可以通过直接降解胶原蛋白或激或纤溶蛋白酶来破坏结缔组织[26]。本研究结果显示，与单纯牙周炎组相比，糖尿病牙周炎组血清TNF-α和IL-6水平升高，说明糖尿病会加重牙周炎大鼠全身炎症情况。GSPE干预后，单纯牙周炎GSPE干预组TNF-α和IL-6水平较单纯牙周炎组降低，糖尿病牙周炎GSPE干预组TNF-α和IL-6水平较糖尿病牙周炎组降低，说明GSPE不仅能够降低单纯牙周炎大鼠血清TNF-α和IL-6水平，还能降低糖尿病牙周炎大鼠血清TNF-α和IL-6水平，推测GSPE通过降低大鼠血清TNF-α和IL-6水平来改善机体炎症状态。

综上所述，GSPE能够降低糖尿病牙周炎大鼠血糖水平，改善牙周组织病理损伤，上调负性脂肪因子脂联素表达，降低促炎因子TNF-α、IL-6表达。本文为临床治疗糖尿病牙周炎提供了新的治疗途径，为探索GSPE防治糖尿病牙周炎提供了一定的实验依据。