血清miR-483-5p miR-487b表达与脓毒症所致急性肺损伤患者炎性因子病情和预后的关系研究

戴 梅， 王 丽， 沙 丹， 张 薇， 王 昕， 雷育军

(1.长江大学附属仙桃市第一人民医院, 湖北 仙桃 433000 2.武汉金域医学检验所有限公司， 湖北 武汉 430000)

脓毒症是宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，脓毒症诱导的全身炎症反应可损害组织和器官功能，其中肺是最易受累的器官之一，表现为肺部大量中性粒细胞浸润，细胞因子、趋化因子和活性氧等过度产生，引起不可控的炎症反应和急性肺损伤(acute lung injury，ALI)[1]。过度炎症反应是ALI发病的主要病理基础，炎症反应可破坏肺泡-毛细血管屏障，导致肺水肿和气体交换严重受损[2]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是天然存在的、高度保守的转录物家族，主要通过促进信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)降解或抑制 mRNA 翻译来调节基因表达，涉及细胞发育、分化和信号传导的各种过程，部分miRNA 参与B 细胞、T 细胞和树突细胞分化和炎症反应调节[3]。miR-483-5p可调节其靶基因-细胞因子信号通路抑制因3促使细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和单核细胞趋化蛋白-1的分泌[4]，miR-487b可靶向白细胞介素-33(interleukin-33，IL-33)抑制巨噬细胞激活，继而抑制IL-33诱导的抗原呈递细胞、共刺激分子以及促炎介质的表达，发挥抗炎作用[5]。miR-483-5p、miR-487b与脓毒症所致ALI的报道十分少见，鉴于此，本研究拟探讨miR-483-5p、miR-487b与脓毒症所致ALI的关系，以期为临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1临床资料:选择2018年9月至2021年12月我院收治的133例脓毒症患者，纳入标准：①脓毒症参考《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)》诊断标准[6]；②年龄18周岁以上。排除标准：①创伤、肺部手术、溺水、有毒气体吸入等导致的ALI；②经临床确诊的肺癌、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、肺纤维化等肺部疾病；③自身免疫疾病，血液系统疾病。其中51例合并ALI(ALI组)，82例未合并ALI(NALI组)，ALI参考2012年柏林急性呼吸窘迫综合征诊断标准[7]。根据氧合指数(氧分压/吸入气氧浓度]将ALI组分为轻度组(201～300mmHg)16例、中度组(101～200mmHg)20例和重度组(≤100mmHg)15例[8]。追踪脓毒症所致ALI患者28d生存状况并将ALI组分为生存组(28例)、死亡组(23例)。另选择同期于我院体检中心体检的43例志愿者为对照组，均排除急慢性感染、肺癌、肺炎、哮喘等呼吸系统疾病。

1.2实验室检测方法:ALI组患者入住急诊重症医学科立即(基线)、住院3d、住院7d(对照组体检当日检测一次，NALI组入院当日检测一次)采集静脉血完善实验室检查，其中干燥试管(3mL)标本室温下静置30～60min后取上层血清离心(3000rpm，半径10cm，时间10min)后-20℃保存备用。取复融血清标本20μL，加入TRIzol试剂(Invitrogen生命技术公司，美国)提取总RNA，全波长酶标仪(型号Multiskan SkyHigh，赛默飞公司，美国)选取OD260：OD2801.8～2.0样本，miRNeasy试剂盒(Qiagen公司，德国)提取miRNA，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit试剂盒(北京天根生化科技有限公司)将miRNA逆转录为cDNA。取2μL cDNA样品加入反应体系，RT-qPCR系统(型号CFX96，BIO-RAD公司，美国)进行基因表达分析，2-ΔΔCt法计算miR-483-5p、miR-487b相对表达水平，引物设计金斯瑞生物科技公司合成，引物序列，反应体系和条件见表1。取复融血清标本，采用Varioskan LUX多功能酶标仪(美国赛默飞公司)运用酶链免疫吸附试验检测血清白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-33水平，试剂盒购自美国赛默飞公司。

表1 引物序列反应体系和条件

2 结 果

2.1ALI组、NALI组、对照组基线资料和实验室指标比较:ALI组、NALI组、对照组年龄和性别比较无统计学差异(P>0.05)，ALI组脓毒症休克比例、机械通气比例、APACHE Ⅱ评分、血清基线miR-483-5p表达，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于NALI组(P<0.05)，氧合指数、血清基线miR-487b表达低于NALI组(P<0.05)，见表2。

表2 基线资料差异

2.2不同病情严重程度患者临床资料血清miR-483-5p、miR-487b表达和炎性因子水平比较:三组住院后miR-483-5p、miR-487b表达，IL-6、TNF-α、IL-33水平差异显著(F组间=56.127、69.353、42.807、39.424、50.247，P<0.05)。轻度组血清miR-483-5p表达，IL-6、TNF-α、IL-33于住院3d轻度升高后，于住院7d下降，miR-487b表达于住院3d轻度下降后，于住院7d增高，中度组和重度组住院后血清miR-483-5p表达，IL-6、TNF-α、IL-33逐渐增高，miR-487b表达逐渐降低(F时间=32.052、41.009、22.427、28.724、30.524，P<0.05)。三组间存在交互效应(F交互=29.352、35.642、15.667、20.598、25.609，P<0.05)。重度组基线、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表达，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于中度组和轻度组(P<0.05)，且中度组高于轻度组(P<0.05)，miR-487b表达低于中度组和轻度组(P<0.05)，且中度组低于轻度组(P<0.05)。重度组APACHE Ⅱ评分高于中度组和轻度组(P<0.05)，氧合指数低于中度组和轻度组(P<0.05)，中度组血清APACHE Ⅱ评分高于轻度组(P<0.05)，氧合指数低于轻度组(P<0.05)。重度组、中度组脓毒症休克比例和死亡率高于轻度组(P<0.05)，重度组、中度组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同病情严重程度患者临床资料和基线血清miR-483-5p miR-487b表达和炎性因子水平差异

2.3脓毒症所致ALI患者不同预后患者血清miR-483-5p、miR-487b表达和炎性因子水平比较:两组住院后miR-483-5p、miR-487b表达，IL-6、TNF-α、IL-33水平差异显著(F组间=63.235、59.485、73.681、42.152、38.452，P<0.05)。生存组血清miR-483-5p表达，IL-6、TNF-α、IL-33于住院3d轻度升高后，于住院7d下降，miR-487b表达于住院3d轻度下降后，于住院7d增高，死亡组住院后血清miR-483-5p表达，IL-6、TNF-α、IL-33逐渐增高，miR-487b表达逐渐降低(F时间=62.351、69.358、43.285、38.152、29.657，P<0.05)。两组间存在交互效应(F交互=26.351、35.652、28.462、30.265、29.449，P<0.05)。死亡组基线、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表达，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于生存组(P<0.05)，miR-487b表达低于生存组(P<0.05)。见表4。

表4 脓毒症所致ALI患者不同预后患者血清miR-483-5p miR-487b表达和炎性因子水平差异

2.4血清miR-483-5p、miR-487b表达与炎性因子水平相关性:脓毒症所致ALI患者基线、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表达与IL-6、TNF-α、IL-33水平呈正相关(P<0.05)，miR-487b表达与IL-6、TNF-α、IL-33水平呈负相关(P<0.05)，见表5。

表5 血清miR-483-5p miR-487b表达与炎性因子相关系数(r，P)

2.5miR-483-5p、miR-487b预测脓毒症所致ALI的价值分析:住院7dmiR-483-5p、miR-487b预测脓毒症所致ALI的曲线下面积高于基线和住院3d miR-483-5p、miR-487b(z=2.156、2.337；2.059、2.097，P<0.05)，基于二元Logistic回归分析联合住院7dmiR-483-5p和miR-487b预测脓毒症所致ALI的曲线下面积为0.964，经DeLong检验大于单独检测(z=2.612、3.141，P<0.05)，见表6和图1。

表6 miR-483-5p miR-487b预测脓毒症所致ALI的效能

图1 miR-483-5p、miR-487b预测脓毒症所致ALI的ROC图

3 讨 论

ALI是临床常见的危及生命的重症疾病，肺部中性粒细胞浸润和介导不可控的炎症反应是导致肺泡毛细血管膜屏障功能障碍、肺水肿、呼吸衰竭和死亡的主要原因[9]。miRNA作为转录后调节因子，参与人类几乎所有的生理病理活动过程，其中不乏炎症反应的调节，据报道miRNA可调节巨噬细胞极化及其诱导的炎症反应[10]，还可直接调节炎症因子参与炎症反应过程[11]。

miR-483-5p与炎症疾病存在密切关系，现有研究发现miR-483-5p可调节血红素加氧酶-1促使氧化应激和肥大细胞成熟、T细胞趋化因子表达以及树突状细胞脱颗粒，导致过敏反应发生[12]，miR-483-5p在特应性皮炎患儿血清中表达上调，调节皮肤慢性炎症反应过程[13]。miR-483-5p在脓毒症中也表达上调，且与脓毒症严重程度以及预后密切相关[14]。但是miR-483-5p是否与脓毒症所致ALI有关尚不清楚。本研究发现ALI组患者血清基线miR-483-5p表达高于NALI组和对照组，说明miR-483-5p与脓毒症介导的ALI也存在密切关系。进一步观察发现ALI组患者中度和重度组基线至住院7d血清miR-483-5p表达逐渐增高，轻度组则在住院3d后表达下降，组间比较中度和重度组基线、住院3d、住院7d miR-483-5p表达均高于轻度组，表明miR-483-5p表达随着ALI病情加重而增加，miR-483-5p表达与ALI病情严重程度有关。信号转导蛋白抑制剂和转录激活因子 1(Protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription-1，PIAS1)是炎症信号网络的重要调节因子，可通过激活调节磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶通路抑制炎性细胞粘附，降低IL-6水平[15]，PIAS1是miR-483-5p的直接靶点，miR-483-5p通过负性调控PIAS1表达增加IL-6和白细胞介素-1β水平，本研究相关性分析结果显示miR-483-5p表达与IL-6、TNF-α、IL-33呈正相关，推测miR-483-5p通过促使炎症反应加剧脓毒症肺损伤进展。本研究结果表明miR-483-5p高表达与脓毒症所致ALI患者预后不良也有关，ROC分析结果也显示住院7d miR-483-5p预测脓毒症所致ALI患者预后具有较高的效能，提示住院7d的miR-483-5p可作为脓毒症所致ALI预后的标志物。

在炎症背景下，miR-487b通过抑制基因转录、阻止翻译和破坏mRNA稳定性来抑制IL-6、TNF-α等细胞因子的产生[16]，miR-487b可直接靶向IL-33，抑制IL-33和生长刺激表达因子2蛋白表达，抑制促炎细胞因子白细胞介素-4、白细胞介素-5和白细胞介素-13水平。本研究发现miR-487b在脓毒症所致ALI患者血清呈低度表达，且miR-487b表达与IL-6、TNF-α、IL-33呈负相关，说明miR-487b是炎症反应的负向调控因子，miR-487b表达缺失可能促使炎症反应，导致脓毒症病情进展。通过追踪临床结局发现miR-487b与脓毒症患者预后有关，死亡组基线至住院7d血清miR-487b表达逐渐降低，且基线、住院3d、住院7d血清miR-487b表达均低于存活组，说明miR-487b持续低表达可促使ALI病情进展和不良结局发生。分析原因为miR-487b表达缺失，其抗炎作用减弱，导致过度炎症反应，加速肺损伤。ROC分析结果显示住院7d的miR-487b预测脓毒症所致ALI患者预后的曲线下面积为0.762，说明住院7d的miR-487b具有预测患者预后的效能，联合住院7d的miR-487b和miR-483-5p后预测效能明显提高，表明住院7d miR-483-5p表达上调，miR-487b表达下调可能预示更高的死亡风险。

综上，脓毒症所致ALI患者血清miR-483-5p表达上调，miR-487b表达下调，miR-483-5p过表达，miR-487b低表达与脓毒症所致ALI患者病情加重和不良预后有关，住院7d的miR-483-5p、miR-487b可作为预后预测的生物学指标。miR-483-5p、miR-487b可能通过调节炎症反应参与脓毒症所致ALI的发病过程。