乙型肝炎病毒/S型区变异特征及其与乙肝疫苗免疫逃逸的研究

曹 阳， 贺晓烨， 李雯莉， 高冉冉， 王 莹

(1.新疆医科大学第一附属医院， 新疆 乌鲁木齐 830000 2.云南省昆明市妇幼健康服务中心基层指导科， 云南 昆 明 650000)

随着乙型肝炎疫苗(hepatitis B vaccine，HepB)应用范围推广，免疫失败问题已逐渐引起广泛关注，其机制可能与疫苗形成的免疫压力导致HBV基因突变，进而造成免疫逃逸存在密切联系[1]。目前已经证实乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)由大、中和小包膜蛋白组成，位于氨基酸99-169序列区域的高度亲水性结构域称主要亲水区(major hydrophilic region，MHR)，其中包含的a决定簇(aa124-147)是诱导B细胞产生抗体和免疫应答的重要抗原表位，同时也是疫苗和抗病毒药物作用靶点[2，3]。目前所用HepB为HBsAg重组蛋白，诱导产生的免疫应答主要针对S基因编码的MHR区域，因此S基因突变，尤其MHR中的a决定簇突变容易造成疫苗免疫失败，导致乙肝疫苗免疫逃避病毒(vaccine escaped HBV，ve-HBV)出现[4]。本研究以1973例接种HepB的人群为样本，分析免疫逃逸发生情况及其与HBV S区基因突变的关系，以进一步明确免疫失败的遗传学机制，现将具体结果详述如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2021年3月至2022年3月我院1973例住院患者为样本进行横断面研究，其中男性1005例，女性968例，年龄3～28岁，平均(17.29±5.46)岁。纳入标准：①均按照卫生部《预防接种工作规范》[5]中规定的0、1、6月标准程序完成HepB接种；②均采集血液样本并完成HBV感染标志物检测；③患者或家属均了解本研究内容并签署同意书。排除标准：①合并手术或输血相关病史；②合并甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)或人类免疫缺陷病毒(HIV)等其它病毒感染；③合并免疫系统疾病；④曾接受抗病毒药物治疗；⑤临床信息不完整。

1.2研究方法

1.2.1HBV血清标志物检测：采集所有研究对象血液样本3mL，以8000r/min离心后3min，取上清100μL并采用Access2全自动微粒子化学发光免疫分析仪(美国Beckman Coulter公司)及配套试剂盒检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc，所有步骤均严格按照说明书要求完成。

1.2.2HBV DNA提取：取HBsAg阳性患者血清200μL于离心管中，然后加入20μL蛋白酶K(德国Qiagen公司)，震荡15s以充分混匀，然后于56℃环境孵育10min，完成后加入无水乙醇200μL，摇匀后转移至收集管离心柱中，在室温条件下以8000r/min离心1min，更换清洁收集管并向离心柱加入500μL AW1洗液，在室温条件下以8000r/min离心1min，去滤液并更换收集管，然后向离心柱加入500μL AW2洗液，在室温条件下以16000r/min离心3min并去除滤液，将离心柱置于1.5mL无菌EP管中，加入30μL AE洗脱液并在室温条件下以8000r/min离心1min，将所得DNA溶液-70℃保存备用。

1.2.3HBV DNA扩增：采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术进行扩增，第一轮反应体系包括10 mM dNTP 2μL，模板DNA 2μL，上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶体系12.5μL、10×PCR buffer 5μL及双蒸水26.5μL，总体积50μL。反应条件为98℃预变性10min，然后98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min。引物由上海生工生物科技有限公司合成，上、游序列分别为5’-ATCCGCTGGATGTGTCTGCG G-3’，下游5’-GGCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’。第二轮反应体系包括第一轮PCR产物5μL，上、下游引物各2μL，Premix Taq DNA聚合酶25μL，双蒸水16μL，总体积为50μL。反应条件为98℃预变性10min，然后98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min。引物由上海生工生物科技有限公司合成，上、游序列分别为5’-TTAGGG TTTAAATGTA TACCC-3’，下游5’-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3’。将PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压100V，时间40min，采用紫外多功能凝胶成像仪(法国Vilber Lourmat公司)观察目标条带。

1.2.4HBV S基因型和血清型分析：取凝胶电泳产物置于EP管中，封口后送交上海生工生物科技有限公司测序，将测序结果整理后与NCBI基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中标准序列(见表1)进行对比和分析，采用MEGA4软件构建系统进化树并鉴定基因型，HBV S基因型判断依据为与参考序列S基因同源性≥96%为同一基因型。采用MegAlign软件分析HBV S基因序列，比对并判断突变发生情况。然后分析S基因中特定位点氨基酸表达情况确定血清型，HBV S共包括adr、adw、ayr和ayw等4种血清型。

表1 HBV S基因型标准参考序列

2 结 果

2.1HepB疫苗免疫逃逸患者流行病学分布：本研究1973例患者中HBsAg阳性标本47份(2.38%)，其中HBsAg/抗-HBc阳性标本26份，占55.32%，HBsAg/抗-HBs/抗-HBc阳性标本3份，占6.38%，HBsAg且抗-HBs/抗-HBc阴性标本18份，占38.30%。年龄>18岁者HBsAg阳性率高于1-18岁人群，父母HBV阴性者HBsAg阳性率低于母亲HBV阳性人群，差异均有统计学意义(P<0.05)，流行病学分布特征详见表2。

表2 HepB疫苗免疫逃逸患者流行病学分布

2.2HBV基因型和血清型分析：47份HBsAg阳性标本中HBV基因型包括B型14例(29.79%)，C型31例(65.96%)和D型2例(4.26%)；血清型包括adr型23例(48.94%)，adw型14例(29.79%)、ayr型8例(17.02%)和ayw型2例(4.26%)，见表3。

表3 HBV基因型和血清型分析

2.3HBV S基因突变位点数量分析：与标准序列相比，47份HBsAg阳性标本共存在核苷酸突变位点162个，其中突变位点数量1-13个，平均(3.45±1.06)个，突变位点众数为3个。47份标本共存在氨基酸突变位点98个，其中突变位点数量0-6个，平均(2.09±68)个，30份HBsAg阳性标本检出氨基酸变异，检出率63.83%，见图1。

图1 HBsAg阳性标核苷酸和氨基酸突变情况分析

2.4HBV S区域核苷酸变异情况分析：基因测序显示HBV S基因突变主要发生于MHR，47份标本中a决定簇(aa124-147)内检出突变位点包括I/T126A/N/I/S、Q129H/R、M133L、K141E、T143S、D144A/EH和G145R/A；a决定簇上游(aa99-123)检出突变位点包括Q101R/H、L110I、G112K、S113T/G、S117G和P120Q/R/L；a决定簇下游(aa148-169)检出突变位点包括Y161F/C、E164D、F161Y和R160K，详见表4。

表4 HBV S区域核苷酸变异情况分析

2.5HBV S基因a决定簇氨基酸变异情况分析：30份发生氨基酸变异的HBsAg标本中，19份存在氨基酸极性改变，占63.33%，其中14份为B亚型毒株，且有11份发生于a决定簇(aa124-147)内，包括T126I、Q129R、T143S、D144A和G145A等5个变异位点，分别导致第126位氨基酸由苏氨酸(Thr)突变为丙氨酸(Ala)，第129位氨基酸由谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)，第143位氨基酸由赖氨酸(Lys)突变为蛋氨酸(Met)，第145位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变为Ala。

3 讨 论

HBV感染是全球重要公共卫生问题，文献报道约有20亿人为HBV感染者或伴感染病史，其中持续感染者数量约2.92亿，可引起肝炎、肝硬化或肝癌等严重病变，且每年致约60万患者死亡[6]。我国为HBV主要流行地区之一，现阶段感染者数量约8600万，自1992年国内开始实施新生儿乙肝计划免疫项目以来，HBV感染率呈现持续下降趋势，但免疫失败率约5%～10%，因此探讨免疫失败发生机制对HBV感染预防和治疗具有重要意义[7]。

本研究以1973例按照0、1、6月标准程序接种HepB疫苗的患者为样本进行横断面分析，结果显示其中HBsAg阳性者47例，阳性率为2.38%，较我国60岁以下居民HBV携带率7.18%明显降低[8]，表明接种疫苗对预防HBV感染具有积极作用，同时也提示我国居民接种HepB疫苗后仍然存在一定免疫逃逸风险，因此HBV感染风险较高的人群需加强体检和监测，以便及时采取预防和治疗措施。同时本研究分析HBsAg阳性患者流行病学特征显示，年龄>18岁者HBsAg阳性率明显高于1-18岁人群，其原因可能与近年来疫苗接种技术快速进步密切相关，且1-6岁儿童HBsAg阳性率仅0.97%，达到卫生部提出的1%以下的要求。关于家族史的分析结果显示父母HBV阴性者HBsAg阳性率明显低于母亲HBV阳性人群，可见HepB疫苗免疫逃逸可能与胎儿在功能已获得感染存在密切联系，从而导致母婴传播阻断失败。

基因型和血清型对判断HBV传播路径具有重要参考意义，文献报道HBV共包括A-J等10种基因型，其中分布于我国的主要为B、C和D三个亚型，优势血清型则为adr型，其次为adw型，因不同血清对HepB疫苗反应效果存在差异，因此免疫失败患者HBV血清型分布也可能发生变化[9]。本研究47份HBsAg阳性标本HBV基因型主要为B型(29.79%)，其次则为C型(65.96%)，另外发现D型2例(4.26%)。HBV血清型有S基因a决定簇产生，根据第122位和第160位氨基酸位点突变情况分为adw、adr、ayw和ayr等4种亚型，本研究47份HBsAg阳性标本血清型包括adr型23例(48.94%)，adw型14例(29.79%)、ayr型8例(17.02%)和ayw型2例(4.26%)，与全国流行规律相比无明显差异[10]。由于样本容量偏小，本研究未根据性别、年龄和家族史等口学特征进一步分析，因此HBV基因型和血清型与HepB疫苗免疫失败是否存在联系，以及不同亚型免疫逃逸风险是否具有差异均还有待深入探讨。

近年来研究表明位于MHR(aa99-169)尤其a抗原决定簇(aa124-147)突变是影响HBsAg抗原性的重要因素，在自然条件、HepB疫苗或抗病毒药物等作用下，a抗原决定簇突变导致HBsAg构象改变和抗原性变化，造成免疫逃逸[11]。Colagrossi等[12]对828位慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者进行分析，结果显示耐药诱导的免疫逃逸检出率为28.6%，主要包括rtM204IsI196S、rtM204V-sI195M和rtV173L-sE164D等。本研究采用PCR技术对HBV S基因进行扩增并测序，结果显示47份HBsAg阳性标本共存在核苷酸突变位点162个和氨基酸突变位点98个，明确存在氨基酸变异的标本为30份，检出率63.83%，表明HepB疫苗免疫逃逸主要与HBV S基因有关。同时本研究基因测序显示HBV S基因突变主要发生于MHR，其中a决定簇(aa124-147)内部突变发生率为53.20%，主要位点包括I/T126A/N/I/S、Q129H/R、M133L、K141E、T143S、D144A/EH和G145R/A等；a决定簇上游(aa99-123)突变发生率为87.24%，主要位点包括Q101R/H、L110I、G112K、S113T/G、S117G和P120Q/R/L等；a决定簇下游(aa148-169)突变发生率为80.85%，主要位点为Y161F/C、E164D、F161Y和R160K；可见发生HepB疫苗免疫逃逸的HBV毒株S基因突变情况较为复杂，可能同时存在a决定簇内外多个位点突变。为进一步明确HBV S基因突变与HepB疫苗免疫逃逸的关系，本研究对氨基酸突变类型进行分析，发现30份发生氨基酸变异的HBsAg阳性标本中，有19份存在氨基酸极性改变，占63.33%，且11份位于a决定簇内，是引起HepB疫苗免疫逃逸的主要原因。本研究检测出的氨基酸突变包括T126I、Q129R、T143S、D144A和G145A等5个位点，其中T126I导致Thr突变为Ala，T143S导致LysMet，G145A导致Gly突变为Ala，均使氨基酸由极性和亲水性和向非极性和疏水性转变，导致抗原与抗体反应性下降，形成免疫逃逸。此外本研究显示Q129R突变可将第129位氨基酸由Gln突变为Arg，亲水性和抗原性均一定程度升高，但可能是由于多点位突变的关系，仍然导致免疫逃逸的结果发生。

综上所述，HBV S基因突变与HepB疫苗免疫逃逸存在密切联系，其中a决定簇(aa124-147)内部T126I、Q129R、T143S、D144A和G145A等位点突变可引起HBsAg极性和亲水性变化，从而导致抗原性下降，造成免疫逃逸发生。本研究主要不足之处为未对不同突变情况下HBsAg结构进行微观分析，尤其当多位点突变同时存在时，HBsAg抗原性变化情况还有待后续开展更多实验进行深入研究，另外还有一部分无义突变和沉默突变与HepB疫苗免疫逃逸的关系也还有待探讨和证实。