芍药内酯苷对新生缺氧缺血性脑损伤小鼠的神经保护的实验研究

阳 梅， 李明玉， 李德渊

(1.四川大学华西第二医院眉山市妇女儿童医院新生儿科， 四川 眉山 620010 2.四川大学华西第二医院新生儿科， 四川 成都 610000)

新生儿围产期缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic ischemic brain injury，HIE)是许多严重人类神经功能障碍的重要危险因素，如运动和学习障碍、脑瘫、癫痫，甚至死亡，占新生儿总数的23%[1,2]。HIE直接导致大量神经元死亡，细胞凋亡为引起神经元死亡的一个重要途径，尤其海马区[3]。机体的炎症、氧化应激反应均能够诱导细胞凋亡。芍药内酯苷是一种单萜苷，是常用中药芍药的活性成分之一。近年来，随着药效学的深入研究，人们发现其具有不同于芍药苷的独特药效学特征，在神经损伤疾病的治疗方面具有独特的优越性[4,5]。磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶/雷帕霉素哺乳动物靶点(Phosphatidylinositol 3-kinase/Serine-threonine kinase/Mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR)信号通路是参与细胞转录、翻译、迁移、代谢、增殖和存活的中央枢纽[6]。多项研究表明，该信号通路激活后可通过减轻自噬发挥神经保护作用[7]。本研究旨在探究芍药内酯苷对HIE脑损伤幼鼠的神经保护作用的机制。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1实验动物来源:45只出生9d的幼鼠及母鼠，来自北京维通利华实验动物公司；合格证号SCXK(京)2018-0032。

1.1.2试剂及器材:芍药内酯苷(货号：39011-90-0)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色液购自北京索莱宝生物技术有限公司；脱氧核苷酸末端转移酶(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，Tunel)试剂盒购自罗氏(Roche)公司；小鼠MDA、SOD、GSH 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒和小鼠白介素IL-6、IL-18、IL-1β ELISA检测试剂盒均购自上海碧云天商务技术有限公司；兔抗鼠ICAM-1多抗、兔抗Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9多抗及兔抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR等一抗均来自艾博抗(上海)贸易有限公司；XBS-02B型全自动缺氧动物模型饲养箱购自杭州艾普仪器设备有限公司；IXplore Pro自动化显微镜系统购自日本Olympus。

1.2方 法

1.2.1新生小鼠缺氧性脑损伤(HIE)模型的制造:将小鼠麻醉、仰卧固定，解剖显微镜下操作：颈中线切开皮肤，分离颈总动脉、内动脉、外动脉，尼龙绳双重结扎颈总动脉，中间剪断颈总动脉，缝合皮肤。将小鼠在电炉旁温暖，直至全部苏醒，再转移至母鼠笼中休息。2h后再将小鼠转移至恒温缺氧箱，10%氧气、90氮气的缺氧箱中维持40min，再放置37℃恒温箱2h，转移至母鼠笼。

1.2.2动物分组:45只小鼠随机分3组，每组15只，分别标记为假手术组、模型组、芍药内酯苷组。模型组、芍药内酯苷组小鼠均需HIE造模。假手术组小鼠，仅做分离颈内、外、总动脉，不做栓塞。模型组小鼠按照上述操作造模。芍药内酯苷组小鼠，造模后给予30mg/kg芍药内酯苷灌胃，每天1次，连续21d。假手术组、模型组小鼠，给予等量的蒸馏水灌胃。

1.2.3指标检测

1.2.3.1脑梗死面积检测:TTC染色法检测小鼠脑梗死：断头法处死小鼠，取新鲜脑组织-20℃，30min，切成2mm。置于TTC溶液孵育30min，白色为梗死区。甲醛中固定，拍照，Image J软件分析脑梗死率(%)为梗死面积与总面积百分率。

1.2.3.2脑组织细胞凋亡检测:Tunel检测细胞凋亡：取新鲜的脑组织，4%多聚甲醛固定12h，制作石蜡切片。按照Tunel试剂盒中石蜡包埋切片的检测方法操作。使用蛋白酶K对二甲苯、梯度乙醇处理的切片进行室温处理15min，PBS冲洗，晾干。湿盒内操作标记、显色：用Tunel反应混合液37℃孵育1h。DAPI室温下反应15min，PBS冲洗，抗荧光猝灭剂封片。荧光显微镜下观察，拍照。Tunel染色阳性凋亡细胞显绿色，DAPI核染细胞显蓝色。阳性凋亡细胞的百分率为脑组织细胞凋亡率。WB检测组织中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达：脑组织匀浆，裂解液冰上裂解，超声裂解，提取总蛋白。对蛋白BCA定量，沸水变性。聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩、分离蛋白，湿转法将蛋白转移至PVDF膜。封闭液对膜封闭处理后滴加一抗溶液(1500倍稀释的兔抗Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9)，37℃孵育2h，PBS冲洗，再滴加二抗溶液(500倍稀释的HRP标记山羊抗兔二抗)，继续孵育1.5h，冲洗。滴加电化学发光显色液，凝胶成像系统曝光。Image J分析条带灰度。

1.2.3.3脑组织氧化应激水平检测:取脑组织匀浆液做样本。按照小鼠MDA、SOD、GSH酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒要求操作，处理样本、判定实验有效性、计算样本中MDA、SOD、GSH的含量。

1.2.3.4脑组织炎症水平检测ICAM-1、IL-6、IL-18、IL-1β:取新鲜的脑组织，4%多聚甲醛固定12h，制作石蜡切片。脱蜡后，反复蒸煮2次，进行热抗原修复。先将组织用山羊血清封闭处理，室温下孵育1.5h。200倍稀释的兔抗鼠ICAM-1多克隆抗体作为一抗，37℃孵育组织1h，500倍稀释的山羊抗兔二抗作为二抗，37℃孵育组织1h。加100倍稀释的链霉亲和素-生物素复合物(SABC)孵育30min，滴加显色液。脱水后，封片，200倍显微镜下观察、拍照。棕褐色为ICAM-1蛋白阳性，用阳性数与总细胞数百分比表示ICAM-1蛋白表达情况。取脑组织匀浆液做样本。小鼠白介素IL-6、IL-18、IL-1β ELISA检测试剂盒分析样本中IL-6、IL-18、IL-1β的含量。具体操作步骤见各个试剂盒说明书。

1.2.3.5脑组织PI3K/AKT/mTOR通路活性检测:脑组织匀浆后，进行蛋白免疫印迹实验，检测其中PI3K/AKT/mTOR通路关键基因PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白表达量。具体操作步骤同1.2.3.2中的蛋白检测方法。

2 结 果

2.1芍药内酯苷对HIE小鼠脑梗死面积的影响:与假手术组相比，模型组小鼠脑梗死率明显升高，与模型组相比，芍药内酯苷组小鼠脑梗死率显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度芍药内酯苷对HIE小鼠脑梗死面积的影响

2.2芍药内酯苷对HIE小鼠脑组织细胞凋亡的影响:与假手术组相比，模型组小鼠脑细胞凋亡率显著升高(图1)，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白显著升高(图2)，与模型组相比，芍药内酯苷组小鼠脑细胞凋亡率降低(图1)，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达也降低(图2)(P<0.05)。见表2。

表2 芍药内酯苷对HIE小鼠脑细胞凋亡的影响

图1 芍药内酯苷对HIE小鼠脑组织细胞凋亡的影响

图2 芍药内酯苷对HIE小鼠脑组织Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达的影响

2.3芍药内酯苷对HIE小鼠脑组织氧化应激的影响:与假手术组相比，模型组小鼠脑组织MDA含量升高，SOD、GSH含量均降低，与模型组相比，芍药内酯苷组小鼠脑组织MDA含量降低，SOD、GSH含量均升高(P<0.05)。见表3。

表3 芍药内酯苷对HIE小鼠脑组织氧化应激的影响

2.4芍药内酯苷对HIE小鼠脑组织炎症因子的影响:与假手术组相比，模型组小鼠脑组织ICAM-1、IL-6、IL-18、IL-1β均显著升高，与模型组相比，芍药内酯苷组小鼠脑组织ICAM-1、IL-6、IL-18、IL-1β均显著降低(P<0.05)。见图3、表4。

图3 芍药内酯苷对HIE小鼠脑组织ICAM-1表达的影响

表4 不同浓度芍药内酯苷对HIE小鼠脑组织炎症反应的影响

2.5芍药内酯苷对小鼠脑组织PI3K/AKT/mTOR通路的影响:与假手术组相比，模型组小鼠脑组织p-PI3K、p-AKT、p-mTOR均显著降低，与模型组相比，芍药内酯苷组小鼠脑组织p-PI3K、p-AKT、p-mTOR均显著升高(P<0.05)。见图4、表5。

图4 小鼠脑组织PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达

表5 芍药内酯苷调控小鼠脑组织PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达

3 讨 论

国内外学者对芍药内酯苷、芍药苷的神经保护功能均有研究[8,9]，但是其发挥保护作用的机制仍未清楚。Wang等[10]制造大鼠蛛网膜下腔出血模型，探究芍药苷的作用发现，芍药苷能改善模型大鼠的神经功能，减少脑含水量，减轻氧化应激反应，抑制活性氧ROS、MDA，SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，抑制小胶质细胞激活和神经炎症反应，降低神经元凋亡率，说明了芍药苷可减轻大鼠蛛网膜下腔出血的早期脑损伤。Jiang等[11]研究发现，芍药苷减轻了缺氧诱导的大鼠脑内神经元损伤及炎性损伤，还减轻缺氧诱导的星形胶质细胞焦亡，进一步研究揭示了芍药苷抑制缺氧星形胶质细胞HIF1a/miR-210/caspase1/GSDMD信号通路的活性，说明了芍药苷通过抑制HIF1a/miR-210/caspase1/GSDMD信号通路改善缺氧诱导的星形胶质细胞焦亡，为缺氧性脑损伤的治疗提供依据。sICAM-1参与新生儿HEI体内免疫反应和炎症反应，其表达上调，诱导炎症介质TNF-α和IL-6大量释放，加重病情[12]。此研究结果显示：芍药内酯苷降低了HIE小鼠的脑梗死率、脑组织细胞凋亡率，下调了SOD、GSH，上调MDA，并下调ICAM-1、IL-6、IL-18、IL-1β，充分说明了芍药内酯苷增强了HIE小鼠抗凋亡、抗氧化应激、抗炎症能力，以发挥对HIE小鼠的神经保护功能。

PI3K/AKT/mTOR通路在脑缺血损伤中的神经保护作用已被广泛研究[12,13]。Wei等[14]研究发现，PI3K/AKT/mTOR信号通路在缺血缺氧性脑损伤新生小鼠中的活性降低，中药氧化苦参碱治疗后该通路的活性得到恢复，小鼠海马组织神经元的自噬得到明显减轻，神经功能得到提高。当归减少缺血性脑卒中小鼠脑梗死，促进神经元的存活，抑制Bcl-2/Bax线粒体功能，其机制为激活PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性[15]。因此，本研究推测，PI3K/AKT/mTOR信号通路可能也参与了芍药内酯苷的药理作用。此研究结果显示，HIE小鼠脑组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达分别下调40%、55.56%、49.31%。芍药内酯苷治疗后，他们的表达均得到了一定恢复，趋于假手术小鼠。这说明了PI3K/AKT/mTOR信号通路确实在HIE小鼠中活性受到抑制，再次验证了前人的实验结果，同时也说明了通路的活性受芍药内酯苷的调控，可能参与了芍药内酯苷的抵抗HIE新生小鼠脑细胞凋亡、氧化应激、炎症的过程。

综上所述，芍药内酯苷抑制HIE新生小鼠脑组织氧化应激、炎症及神经元凋亡，降低脑梗死面积，产生这种神经保护作用的机制与激活PI3K/AKT/mTOR信号通路相关，为芍药内酯苷用于临床保护神经奠定基础。