加格达奇地区发生松材线虫病的风险性预测1)

崔嵘 潘龙 张吉利 王烁荣贵纯 理永霞 张星耀

(中国林业科学研究院生态保护与修复研究所，北京，100091)(中国林业科学研究院寒温带林业研究中心)(中国林业科学研究院生态保护与修复研究所)(中国林业科学研究院森林环境与保护研究所)

松材线虫病(Pine Wilt Disease)即松树萎蔫病，是一种以松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)为病原[1]，墨天牛属(Monochamusspp.)昆虫为主要媒介，综合人为参与、寄主松树和环境等因素互作的一种复杂的病虫害[2-5]。松材线虫的生活史可分为繁殖型周期和扩散型周期，在适宜的环境下，松材线虫进入繁殖型周期，种群数量不断增加，造成松树生长衰弱或发病死亡；在不良环境条件下，松材线虫进入扩散型周期即滞育型周期。当媒介昆虫羽化为成虫时，松材线虫进入媒介昆虫体内[6-7]，在媒介昆虫羽化后取食健康松树时，松材线虫侵入健康松树体内，在适宜的环境条件下解除滞育转型并发育为成虫，进入繁殖周期开始大量繁殖危害松树，导致病害扩散蔓延。在自然条件下形成松材线虫(病原)、松墨天牛(传播媒介)和松树(寄主)三者之间的侵染循环[8-9]。线虫在低温不利条件下(-20～80 ℃)会进入“假死”(隐生)状态[10-12]，可以在低温等极端环境中生存，并在环境恢复适宜的情况下结束隐生状态继续危害树木[13-15]。被松材线虫感染后的松树，针叶黄褐色或红褐色，萎蔫下垂，树脂分泌停止，树干可观察到天牛侵入孔或产卵痕迹，病树整株干枯死亡，最终腐烂[16]。

由于松材线虫病发病致死速度快，传播蔓延迅速，难以预先诊断，防治难度大，且感染后的松树无法被治愈，被称为“松树的癌症”[17]。在我国松材线虫病的分布区，自然感病的寄主包括马尾松(Pinusmassoniana)、黑松(Pinusthunbergii)、白皮松(Pinusbungeana)、红松(Pinuskoraiensis)等松科松属树种[18-19]。目前松材线虫病在我国已造成180.92万hm2的松树的死亡[20]，对我国森林森态系统造成极大的威胁。据国家林业局2021年第5号和14号公告，松材线虫病疫情已扩散19个省市自治区[21-22]。而辽宁省、和吉林省爆发松材线虫病的现象，标志松材线虫病已向北扩展到年均温2～8 ℃，且冬季寒冷干旱，最低温在-20 ℃以下季风控制的中温带地区[23-25]。

目前，许多关于松材线虫风险分析预测的相关报道，从不同角度对松材线虫病的扩散风险进行了分析。韩阳阳[26]利用Maxent生态位模型，结合地理信息系统ArcGIS，对松材线虫在中国的适生区范围进行了预测；于治军等[27]以经典的生物学、生态学理论方法为基础，建立松材线虫适生性数学生态模型预测不同增温模式下松材线虫气候适生性概率分布；叶明福[28]运用有害生物风险分析( PRA)原理，对松材线虫生物学特性、地理分布区、寄主植物、传播媒介、气候条件、天敌、扩散途径等方面进行总结和分析的同时，利用林业有害生物风险评估指标体系，量化赋值计算分析评估松材线虫病在安徽省舒城县扩散风险；季英超利用气候动态模型CLIMEX预测松材线虫病在山东省的适生性，并根据有害生物危险性分析方法对松材线虫病在山东省的风险性等级作了综合评价[29]；有的采用区域性林业有害生物风险分析指标体系对未发生松材线虫病地区的松材线虫病的入侵风险进行了赋值风险分析评估[30-31]。然而对加格达奇地区松材线虫病入侵风险性评估的研究却很少。

加格达奇地区是我国用材林以及防护林等重要的区域，有大量兴安落叶松(Larixgmelinii(Rupr.) Kuzen)和樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)人工林的分布。因此，对该地区松材线虫病的监测预警以及风险性分析预测具有重要意义。本研究采用多指标综合评价的方法对松材线虫病在寒温带加格达奇地区的松材线虫病发生风险性进行综合分析，为寒温带林区的松材线虫病风险防控提供理论支撑。

1 研究区概况

加格达奇位于黑龙江省西北部，地理坐标为东经123°45′45″～126°4′，北纬50°5′16″～51°12′40″，年平均气温为-2 ℃，最低气温可达-45 ℃，年平均降水量为495 mm，其森林覆盖率为60.2%。该地区针叶林树种以兴安落叶松和樟子松为主[32]，部分林区有红松(Pinuskoraiensis)、偃松(Pinuspumila)、红皮云杉(Piceakoraiensis)等针叶树种分布。

2 研究方法

2.1 松材线虫适生区分析

根据松材线虫病的已知分布及其生物学数据，使用气候动态模型CLIMEX 3.0设定其适生区预测的初始参数值，并根据其在全国的分布范围作为参数调整的依据，确定松材线虫适生区预测模型的最终参数值：发育起点温度为10 ℃，最适温度范围15～29 ℃、发育致死温度为33 ℃，冷和热抑制开始积累时的温度阈值分别为-18、35 ℃、冷和热抑制积累速率分别为-0.01、0.002，干和湿抑制开始积累时的湿度阈值分别为0.05、1.5)、干和湿抑制积累速率分别为-0.005、0.001 5，以及有效积温为150 ℃/d。使预测的适生区与当前分布最大程度拟合得到最终参数值并获得加格达奇区所有气象站点的生态气候指数(EI)值，导入ArcGIS10.2软件，最终生成松材线虫寒温带的适生区分布图。

2.2 媒介昆虫的种类统计

于2019年和2020年6—9月天牛羽化高峰期，在加格达奇营林局樟子松与兴安落叶松人工林样地中悬挂松墨天牛诱捕器(杭州费洛蒙生物科技有限公司)，收集墨天牛属天牛，每隔7 d收集一次，对收集到的天牛成虫可参考《东北天牛志》、《中国经济昆虫志：鞘翅目：天牛科(一)》、《中国经济昆虫志：鞘翅目：天牛科(二)》、《中国经济昆虫志: 鞘翅目：天牛科(三)》等书籍[33-36]，从体色、体长、鞘翅斑纹、小盾片、前胸背板和触角等形态特征对收集到的天牛成虫样品进行形态学鉴定，并统计各个时间内的不同种类的天牛数量。

2.3 线虫的分离与鉴定

选取样地内针叶呈黄绿或黄褐色，尚未完全枯萎，树皮尚未脱落，材质尚未腐朽的落叶松与樟子松的优势木，观察羽化孔、排粪孔和刻槽，综合判断是否有疑似媒介昆虫的危害。在离地1.5 m处取样，在取样部位分别截取5 cm厚的圆盘带回实验室进行后续试实验。所取的样品记录样品号、取样地点、树种、树高、树龄、胸径和健康等级，是否存在羽化孔、排粪孔、刻槽等天牛危害特点，最后标注取样时间和取样人等信息。

将采样获得的木段用枝剪剪成“火柴杆”状大小后，用两层纱布包好，放入漏斗中，采用贝尔曼漏斗法进行线虫分离，24 h后用离心管收集线虫分离液，离心后用 200 μL 移液枪吸取底部线虫混合液滴至载玻片上进行松材线虫形态鉴定[37]。

用10 μL移液枪在显微镜下挑取分离线虫液中50头线虫，装入离心管内，利用DNA制备试剂盒AP-MN-MS-GDNA-50(美国Axygen公司生产)，按照试剂盒要求的步骤提取线虫DNA，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和测序[38]。PCR扩增反应体系：共25 μL，包括12.5 μL PCR Mix，正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，9.5 μL ddH2O(双蒸水)。选择ITS(内源转录间隔区)(上游引物F1：5’-CGT AAC AAG GTA GCT GTA-3’，下游引物V2：5’-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3’)通用引物和28S(上游引物D2A：5’-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG -3’，下游引物D3B：5’-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3’)松材线虫特异性引物。PCR反应程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。将PCR获得的产物进行测序，并将测序结果与NCBI(美国国立生物技术信息中心)文献进行比对。

2.4 松材线虫传入加格达奇地区风险评估

松材线虫病在加格达奇地区的风险等级评估，借鉴有关文献[30，39]的风险分析指标体系及赋分标准，从当下松材线虫分布范围以及对于加格达奇潜在的危害性、传播与定殖的可能性、当地寄主的经济重要性和检疫管理的难易性等多个指标，并结合松材线虫病的发生、传播、危害、检疫和控制等的实际情况，对加格达奇地区传入松材线虫病的风险性进行赋值评估，并根据计算结果，确定加格达奇地区传入松材线虫病的风险性。

3 结果与分析

3.1 松材线虫适生区分析

由1图可知，根据气候条件及松材线虫生物学特性，我国多数地区为松材线虫的适生区，其中我国寒温带地区同样也在适生区范围(东经119°1′46″～127°38′31″，北纬50°～53°37′12″区域)，该地区低适生区与中适生区的分界在东经125°12′9″，北纬50°～51°16′39″。根据寒温带加格达奇地区经纬度信息(东经123°45′45″～126°4′，北纬50°5′16″～51°12′40″)，可判定加格达奇地区大部分位于松材线虫适生范围内的中适生区，松材线虫侵入寒温带加格达奇地具有很大的风险，也就是说松材线虫具有在该地区适生、传播并危害可能性，因此，后续的监测预警工作十分有必要进行。

图1 松材线虫在我国的适生区

3.2 加格达奇地区枯死松树线虫鉴定

3.2.1 形态鉴定结果

由图1可知，经过贝尔曼漏斗法后从寒温带地区部分病死的樟子松枯立木分离到的线虫，雄虫基顶钝圆交合刺大，弯成弓状，远端膨大无引带(见图2A、图2B)。雌虫尾部呈圆椎形，尾端指状，有明显的尾尖突(如图2C，图2D)。显微镜下观察到的形态特征与松材线虫(B.xylophilus)和拟松材线虫(Bursaphelenchusmucronatus)的部分形态特征相符合，而具体分离到的线虫为哪种，需要利用分子鉴定进一步确认。

A. 雄虫形态特征；B. 雄虫尾部特征；C. 雌虫形态特征；D. 雌虫尾部特征。

3.2.2 分子鉴定结果

选择ITS序列引物，对加格达奇地区枯死的樟子松中分离到线虫的DNA为模板进行PCR扩增和测序。结果发现ITS通用引物和28 S松材线虫特异性引物均无松材线虫的序列产生；而ITS通用引物产生的长度为876 bp的序列片段，与NCBI上已提交的拟松材线虫的ITS序列HM590212.1的相似度为98%，同源覆盖率为95.07%，E值为0。

3.3 加格达奇地区媒介昆虫调查

3.3.1 媒介昆虫种类确定

依据《东北天牛志》等书籍相关内容从体色、体长、鞘翅斑纹、小盾片、前胸背板和触角等形态特征对收集到的天牛成虫样品进行形态学鉴定：

1.鞘翅基部1/3处有清晰的横压痕，小盾片有密集整齐的淡黄绒毛

2

鞘翅基部1/3处无清晰的横压痕,小盾片有1条从基部到端部或仅基半部的光滑纵中线

3

2.鞘翅端部1/4有密集明显的黄白色绒毛，刻点在翅端很细密

云杉大墨天牛

鞘翅端部1/4没有明显密集的黄白色绒毛，刻点分散而明显粗糙

云杉粗鞘墨天牛

3.鞘翅仅在基部1/4有清晰密集的刻点,端部区域有很密的暗褐色绒毛，点缀着白色或淡黄色斑，其上只有微小细弱稀疏的刻点；光滑的纵中线纵贯整个小盾片

云杉花墨天牛

整个鞘翅具有明显而粗糙的刻点,即使覆盖有浓密的绒毛也能看见,小盾片有1条从基部到端部完整或仅存在于基半部的光滑纵中线

4

4.小盾片上光滑纵中线从基到端部完整；在鞘翅基部，小盾片之后主要为简单的刻点，刻点间平坦

云杉小墨天牛

仅在小盾片基部有光滑的短纵中线;鞘翅基部，小盾片后方有颗粒状刻点，刻点间表面凸出

樟子松墨天牛

依据上述形态特征对收集到的天牛成虫样品进行种类鉴定，并结合前人研究所报道的研究确定媒介昆虫种类[40-42]，确定寒温带加格达奇地区存在的媒介昆虫种类主要为有樟子松墨天牛(Monochamus.galloprovincialis)、云杉大墨天牛(Monochamusurussovi)、云杉小墨天牛(Monochamussutor)以及云杉花墨天牛(MonochamussalturariusGebler)(见图3)。

A．樟子松墨天牛；B. 云杉小墨天牛；C. 云杉大墨天牛；D. 云杉花墨天牛。

3.3.2 羽化后不同时间下的媒介昆虫种群密度调查

将所有诱捕器中诱捕到天牛制作成标本，将各个时间段诱捕器内的媒介昆虫(墨天牛属天牛)数量进行整理，并计算单诱捕器内媒介昆虫的平均数量。由表1可知，寒温带加格达奇地区媒介昆虫成虫在6月中上旬开始羽化，7月下旬至8月上旬成虫的单诱捕器平均数量最多，9月上旬之后基本没有羽化后的成虫活动。

表1 不同时段不同林分类型样地内平均每个诱捕器诱捕媒介昆虫数量

P1可直接根据表内的评分指标赋分得到。P2采用连乘关系，P3和P5采用累加关系，P4采用替代关系。计算公式如下：

P1=P11；

P3=0.4×P31+0.4×P32+0.2×P33；

P4=Max(P41，P42，P43)；

P5=(P51+P52+P53)/3。

建立风险综合评价值(R)与风险等级的对应关系，其计算方式为：

根据计算，加格达奇地区风险综合评价值R=2.69。参照结合现有的林业有害生物风险分析等级划分R值的区间(2.50≤R<3.00 为特别危险，2.00≤R<2.50为高度危险，1.50≤R<2.00为中度危险，0≤R<1.50为低度危险)判定，松材线虫病入侵寒温带加格达奇地区的风险为特别危险等级。

3.4 松材线虫传入加格达奇地区风险评估

由表1可知，根据松材线虫病生物学特性、发生规律、危害特点、防治情况，参考目前有害生物风险分析评价体系，并结合加格达奇当地寄主种类、种植面积以及当地温湿度等因素确定松材线虫病在寒温带加格达奇地区的入侵风险性评估指标[39]，包括一级指标5项，二级指标14项，并参考相关松材线虫病以及其它病虫害风险性分析的赋值依据[30]，对寒温带加格达奇地区的松材线虫病入侵的风险性评估进行权重赋值[43-47]。

表1 松材线虫病在寒温带加格达奇地区入侵风险评估标准及赋值权重

4 结论与讨论

据国家林业局 2021 年第14号公告，目前我国松材线虫疫区最北已经扩散到我国吉林省汪清、通化等区域[22]。加格达奇地区作为寒温带的代表地区，其所在大兴安岭林区拥有我国保存完好面积最大原始森林，具有大量的落叶松与樟子松的人工林分布。本研究利用气候动态模型CLIMEX模型方法，并综合气候因素与松材线虫生物学特性的因素预测了松材线虫的潜在适生地理分布。根据寒温带所在的地区的松材线虫适生情况，并结合当地寄主植物体内线虫分离、以及媒介昆虫情况，对加格达奇地区松材线虫侵入风险进行了预测。由于松材线虫病的发生是多重因素互作的结果，物种对气候的适宜性并不是确定物种潜在分布区的唯一标准，物种的扩散、物种间相互作用关系、寄主种类及适应性、传播媒介、人为干扰等也是需要考虑的重要因素[48-49]。因此，在排除人为干扰的情况下，本研究预测的松材线虫适生区的结果较为可靠。预测结果显示加格达奇大部分地区为松材线虫中适生区，当松材线虫侵入到寒温带加格达奇地区能够在该地区适生传播并危害当地松树。

在加格达奇地区对枯死松木进行实验分离中，虽然未分离到松材线虫，证明了加格达奇地区暂无松材线虫病的发生。但是分离的过程中发现了活体的拟松材线虫(B.mucronatus)，许多研究证明拟松材线虫和松材线虫的生理所需的环境条件几乎相同，并同样也对松树产生一定的危害[50]，侧面证明了松材线虫能够在加格达奇地区适生[51]。加格达奇地区媒介昆虫的调查结果发现该地区具有4种可传播松材线虫的媒介昆虫的分布，证明了松材线虫传入后可以被媒介昆虫携带并扩散。前期研究发现松材线虫在我国高纬度低温地区定殖时会以扩散型3龄幼虫的虫态存在，在温度低于-20 ℃的情况下，线虫将脱水休眠进入隐生状态，以保证在极寒状态下保持存活，当温度回暖到适宜正常生理活动时，线虫将复水解除隐生状态继续危害松树[15，52]。

对松材线虫适生区预测、媒介昆虫收集和线虫分离鉴定的结果可作为传入定殖、扩散可能性危险性的一级指标赋值的重要参考；适生区预测的结果直接为二级指标中的松材线虫存活率、适应性、扩散能力的赋值提供参考；媒介昆虫直接为二级指标中的松材线虫被携带的可能性、自然扩散能力的赋值提供参考；线虫分离鉴定的结果侧面为二级指标中的松材线虫存活率、适应性的赋值提供参考。结合松材线虫寄主植物种类与分布、松材线虫病的潜在的危害性、传播与定殖的可能性、寄主的种类和分布、以及检疫管理的难易性等5个指标[35]，赋值评价松材线虫侵入加格达奇地区的风险性，加格达奇地区风险综合评价值R=2.93，判定加格达奇地区为侵入风险性极大。综合媒介昆虫和当地气候条件以及松材线虫隐生特性，判断松材线虫侵入寒温带加格达奇地区，必然会在该地区适生扩散并对当地松林资源产生重大的危害。

综上所述，加强该地区对防止松材线虫病入侵的相关管控十分必要。首先，要严格把控检疫关口防止可疑木材或木制品进入寒温带地区，作为松材线虫病的适生区，对来自疫区省份或来源不明的松科植物及其产品进行严格复检和跟踪调查；其次完善检疫手段及相关设备的购置，增加普及分子生物学鉴定技术，并不断学习先进有效的松材线虫检疫技术，提高基层检疫准确率；再次加强该地区媒介昆虫的监测与预警措施做好预防，除林间踏查外，应在重点地区设置松材线虫病媒介昆虫诱捕器、诱木截获媒介昆虫、诱集天牛产卵等方式阻断松材线虫传播。同时加强林业及相关工作人员(检疫人员、普查队员、护林员)对松材线虫病专业知识的培训提高业务水平，增强林业从业人员对于松材线虫病的防范意识。