外施褪黑素对干旱胁迫的长序榆光合与碳氮磷积累及其化学计量比的影响1)

洪震洪琮浩徐艳 闫道良

(华东药用植物园科研管理中心，丽水，323000)(北京林业大学)(省部共建亚热带森林培育国家重点实验室(浙江农林大学))

由于人类活动的深刻影响及降雨频率的总体偏少，导致干旱在全球范围内发生的频次和程度在加剧[1]。干旱胁迫是影响植物生理行为和生长的一个关键限制因子，可以影响植物的许多代谢和生理过程，其中干旱胁迫影响到的主要生理过程是光合作用[2]，干旱可以引起气孔导度降低及关闭，显著降低植物的光合作用和碳汇功能[3]，因此干旱胁迫是限制植物乃至陆地生态系统生产力的主要环境因子。

长序榆(Ulmuselongata)隶属榆科(Ulmaceae)榆属(Ulmus)，落叶乔木，是我国特有的极小种群物种之一，同时，也是优质的材用和造林树种，并具有重要的科研价值，被列为国家Ⅱ级保护植物[4]。近年来，除了加大对长序榆的生境保护之外，人为繁育并扩大种群数量是加强长序榆保护和利用的重要举措[5]。调查中发现，在栽培长序榆过程中，干旱胁迫尤其是脆弱阶段的幼苗期遭遇干旱是影响长序榆正常生长发育的主要限制因子。同时，对长序榆进行水分适应性研究表明，长序榆更适宜生长在湿润环境中，其在幼苗期的光合作用对水分缺失较敏感[6]，土壤水分缺少引起的干旱胁迫是长序榆生长的限制因子，因此，提高长序榆苗期的抗旱能力具有重要的理论和实践意义。褪黑素是具有生理调节作用的小分子物质，可诱导植物提高对多种非生物胁迫的抵抗性[7]。众多文献研究报道集中在经济作物和蔬菜方面，如外源褪黑素缓解经济作物大豆对干旱及低温的胁迫[8-9]，促进盐渍黄瓜幼苗的生长等[10]。在林业生产中，林木同样会面对各种非生物胁迫，研究表明，褪黑素对提高干旱胁迫下北美红栎叶片的抗氧化酶活性，消除积累的活性氧能力等方面具有明显的作用[11]。因此，本文以1年生长序榆实生幼苗为研究材料，以聚乙二醇6000(PEG)模拟干旱胁迫，通过叶面喷施褪黑素溶液，测定了长序榆叶片表观形态及植株生物量积累、光合作用主要参数、有机碳物质积累及对氮磷的积累和他们之间的计量关系，探讨外源褪黑素对干旱胁迫下长序榆幼苗发育的缓解效应，以期为褪黑素的开发利用和长序榆的抗性研究提供理论依据。

1 材料与方法

长势一致的1年生长序榆实生苗，株均高为(20±2.5)cm。把营养钵中的试验小苗于4月中旬移栽进口径为18 cm、高为20 cm的黑色塑料钵中，每塑料钵内装有等量的混合基质河沙和蛭石(V(河沙)：V(蛭石)=3∶2)作为定植基质，每钵定植1株，缓苗2周后进行试验处理。模拟干旱胁迫使用的试剂为PEG，处理液为用1/2MS营养液(大量元素)配制不同质量分数的PEG(质量分数0、10%和20%)作为模拟干旱胁迫的梯度，于干旱胁迫前3 d，每天19:00—19:30均匀足量叶面喷施浓度为100 μmol/L的褪黑素(褪黑素浓度的配置及干旱梯度设置，均经过预试验)。试验设置6个处理组：CK(对照，营养液浇灌+叶面喷施自来水)、M(营养液浇灌+叶面喷施褪黑素)、P10(中度干旱，10% PEG浇灌)、MP10(叶面喷施褪黑素+10% PEG浇灌)、P20(重度干旱，20% PEG浇灌)和MP20(叶面喷施褪黑素+20% PEG浇灌)，每组5个重复，共30株小苗。干旱胁迫处理后，每隔3 d喷施1次褪黑素，共喷施5次，每隔5 d浇灌1次处理液，直到试验结束。为保证基质内处理液的稳定，每次浇灌足量的处理液，直到钵底有一定量的液体流出为准。所有处理的试验材料至于室外自然条件下生长，上罩一层70%透光率的遮阳网，遇雨遮挡。处理45 d后采样测定，分离根、茎、叶，烘干至恒质量测定生物量。

1.1 生长及光合指标测定

用千分之一电子秤称量根和叶质量。选取叶位一致的长序榆叶片，利用Li-6400便携式光合测定系统(LI-COR,Inc.,Lincoln,USA)测定叶片气体交换参数。测定时间为上午08:00—11:00，测定时的叶室温度设置为室外生长温度，约(24±3)℃，叶室CO2摩尔分数约为400 μmol·mol-1，叶室气体流速为500 μmol·s-1，光合有效辐射(PAR)为720 μmol·m-2·s-1。测定的气体交换参数包括叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(C)、胞间CO2摩尔分数(Ci)和蒸腾速率(T)等。每个处理选5枚叶片，5次重复测定，并计算植物叶片的水分利用效率(WUE)=Pn/T。

1.2 碳氮磷与可溶性糖和淀粉测定

把长序榆的根、叶分开后置于烘箱内105 ℃杀青30 min，然后用烘箱70 ℃烘干至恒质量，粉碎、过筛处理后进行元素测定，分别用重铬酸钾-外加热法、凯氏定氮法、钼锑抗比色法，测定根、叶的有机碳、全氮、全磷的质量分数，可溶性糖和淀粉质量分数测定采用蒽酮比色法，非结构性碳水化合物质量分数=可溶性糖质量分数+淀粉质量分数。各指标均是5株重复处理样本的统计值。

1.3 数据分析

试验中所有数据均用Microsoft Excel、SIGMAPLOT 12.5软件进行数据统计分析。使用邓肯法进行多重比较(P<0.05)。所有数据是5次重复数据的“均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 外施褪黑素对干旱胁迫下长序榆叶片形态及生物量积累的影响

由图1可见，施加PEG后，长序榆叶片受到不同程度的干旱伤害。10% PEG处理下，仅叶尖和叶缘受到轻微伤害。20% PEG处理下，叶片受损严重，边缘1/2以上面积出现黄化失绿。喷施褪黑素后，有效地保护了干旱胁迫对长序榆叶片造成的损伤，黄化面积明显减少。

由表1可见，中度干旱对叶和根生物量的积累没有明显的抑制作用，高度干旱则显著降低了叶生物量的积累。施加褪黑素后，减轻了干旱对叶和根生物量积累的抑制作用，尤其在高度干旱胁迫下，褪黑素施加后明显减缓了干旱对根生长的抑制作用，这说明了干旱胁迫下施加褪黑素增强了根生物量的积累，对于维持根正常功能的发挥有重要的意义。

图1 干旱胁迫时喷施褪黑素的长序榆叶片形态特征

表1 干旱胁迫时喷施褪黑素的长序榆生长情况 g·株-1

2.2 外施褪黑素对干旱胁迫下长序榆光合特性的影响

由表2可见，与对照相比，施加褪黑素显著提高了长序榆的净光合速率Pn，而干旱胁迫则明显降低了长序榆的Pn。施加褪黑素后，Pn和水分利用效率WUE虽有所增加，但和未施加相比，差异并不明显。与对照相比，干旱胁迫显著提高了长序榆的胞间二氧化碳浓度Ci。施加褪黑素后明显降低了轻度胁迫下的Ci，但并不能明显降低重度干旱胁迫下的Ci。相反，气孔导度在干旱胁迫下明显降低，施加褪黑素后虽然气孔导度有所提高，但并不能明显提高干旱胁迫下的气孔导度(表3)。

表2 干旱胁迫时喷施褪黑素的长序榆净光合速率、水分利用效率和胞间CO2摩尔分数

由表3可见，干旱胁迫显著增加了气孔限制值(Ls)，重度胁迫下Ls达到最高。施加褪黑素后，明显降低了中度干旱胁迫下的Ls，但并没有明显影响重度干旱胁迫下的Ls。与对照相比，干旱胁迫明显抑制了长序榆的蒸腾速率(Trmmol)，施加褪黑素后虽然对Trmmol的影响有所提高，但并不明显。

表3 干旱胁迫时喷施褪黑素的长序榆气孔导度、气孔限制值和蒸腾速率

2.3 外施褪黑素对干旱胁迫下长序榆碳水化合物质量分数的影响

对干旱胁迫下的长序榆研究表明，褪黑素显著降低了干旱胁迫下长序榆根中可溶性总糖质量分数，如P10、P20处理下施加褪黑素比未施加的根中可溶性总糖质量分数分别下降了24.94%和34.33%，褪黑素对重度干旱胁迫下叶中可溶性总糖质量分数没有明显影响，相反，叶中的总淀粉质量分数则显著增加，分别比未施加褪黑素提高了26.07%和23.28%。MP10处理下根中的总淀粉质量分数比P10增加了15.63%，MP20处理下却比P20处理下总淀粉质量分数表现明显下降(表4)。

表4 喷施褪黑素时长序榆可溶性总糖和淀粉质量分数

由表5可见，与对照相比，施加褪黑素显著降低了叶中的非结构性碳水化合物质量分数，而MP20处理下非结构性碳水化合物质量分数却比P20处理下提高了13.99%。在根中，MP10处理比P10处理下非结构性碳水化合物质量分数提高了7.80%，MP20处理下的非结构性碳水化合物质量分数却显著低于P20处理下的非结构性碳水化合物质量分数。以上结果说明，干旱胁迫下长序榆根和叶对褪黑素处理后非结构性碳水化合物质量分数积累存在各异。

表5 喷施褪黑素时长序榆非结构性碳水化合物质量分数

2.4 外施褪黑素对干旱胁迫下长序榆碳氮磷及其计量关系的影响

本研究通过对干旱胁迫下施加褪黑素对长序榆C、N、P元素在叶和根的含量及w(C)∶w(N)、w(C)∶w(P)和w(N)∶w(P)的计量特征不仅与器官有关，而且对褪黑素施加后的响应也存在差异。和对照相比，施加褪黑素明显提高了叶和根中的C质量分数，施加褪黑素没有影响P10胁迫下的C质量分数，却显著提高了P20胁迫下的C质量分数。干旱胁迫下，施加褪黑素后，提高了叶中的N和P质量分数，却明显降低了根中的N和P质量分数(表6)，这对于光合作用器官叶来说，维持N、P的稳定，有利于叶发挥正常的生理代谢功能。

表6 喷施褪黑素时长序榆碳氮磷质量分数

与正常生长条件相比，植物在逆境下对元素的利用具有较高的效率，也即植物吸收单位的N、P，则会有更高的碳水化合物合成，表现为w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值提高，反之亦然。本研究结果表明，和对照相比，P10、P20干旱胁迫显著提高了长序榆叶的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值，而显著降低了根中的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值。在叶中，MP10、MP20处理下的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值分别相比P10、P20来说，则有不同程度的降低，说明褪黑素对长序榆的干旱胁迫具有不同程度的缓解效应，同时，施加褪黑素后，w(N)∶w(P)比值表现不同程度的下降(表7)。从表7中还可以看出，干旱胁迫下，施加褪黑素使根中的w(C)∶w(N)、w(C)∶w(P)比值均表现不同程度的提高，这有利于根系积累更多的能量物质以吸收N、P供给叶片的需要。

表7 喷施褪黑素时长序榆碳氮磷间计量关系

3 讨论与结论

植物的形态特征与生物量积累是植物响应外界环境变化的最直接表现。在干旱胁迫下，植物往往通过降低株高，减少叶面积、增加根生物量等策略来维持自身的生长发育[12]。通过PEG模拟的干旱胁迫表明，长序榆的叶片随着胁迫程度的不断增加，黄化现象越严重，这会直接影响叶片功能的正常发挥，导致植株的生长发育受到抑制。喷施褪黑素后缓解了干旱胁迫下叶片的黄化现象，同时减轻了干旱对叶和根生物量积累的抑制作用，尤其在重度干旱胁迫下，对长序榆的根生物量积累的抑制有明显的缓解作用，说明外源褪黑素对干旱胁迫下植物生长策略的改变具有一定的解除作用，从而有效缓解干旱胁迫对长序榆生长发育的抑制作用。这与施加外源褪黑素能有效缓解干旱胁迫对叶绿素的破坏作用，提高植物光合作用，延缓叶片衰老，促进根系生长及代谢产物积累的研究相一致[11，13-16]。

光合作用是植物碳物质合成，促进植物生长发育和根、茎、叶等各构件形成的物质和能量基础，是绿色植物体重要的代谢过程。植物受到干旱胁迫会关闭气孔，减少水分蒸腾，同时也阻止了外界CO2进入细胞，植物的光合碳固定能力下降，最终使植物的生长受到抑制[17]。本试验研究表明，长序榆在正常生长条件下，施加褪黑素明显提高了叶片的净光合速率，而在干旱胁迫下施加褪黑素没有明显提高叶片的净光合速率和水分利用效率。本研究还发现，干旱胁迫下，胞间二氧化碳摩尔分数均比对照有明显增加，这与对大豆进行干旱胁迫导致胞间二氧化碳摩尔分数下降的研究结果并不一致[16]，说明极小种群植物长序榆可能存在与大豆等植物适应干旱胁迫下不同的CO2来源机制(非气孔因素)，值得进一步深入研究。同时，施用褪黑素均能提高叶片气孔导度，降低气孔限制值，从而有利于胞间二氧化碳摩尔分数的积累，提高CO2吸收速率及碳物质固定能力，表明施用褪黑素可以缓解干旱导致气孔因素影响CO2吸收的限制，促进长序榆碳同化能力的增强。

植物光合碳同化过程中形成的碳水化物是植物基础的代谢物质和最主要的渗透调节物质，同时也与植物对逆境的生存策略密切相关，这类碳水化物主要包括可溶性总糖和淀粉[18]。它们累积量的大小可以很好地反映植物体内碳供应与碳需求的平衡关系[19]。研究表明，树体不同器官通过调配可溶性总糖和淀粉相对含量以适应环境及季节变化[20]。本研究结果表明，干旱胁迫没有明显影响长序榆叶片的可溶性总糖质量分数，显著降低了叶片中的淀粉含量，但干旱胁迫明显增加了根部的可溶性总糖质量分数，显著降低了其中的淀粉含量，说明干旱胁迫下长序榆可能通过促进叶片和根内的淀粉向可溶性总糖转化，以平衡呼吸作用等生理过程对可溶性总糖的消耗，借以调节体内细胞的渗透势和水分平衡来适应干旱环境。喷施褪黑素后明显降低了干旱胁迫下根中可溶性总糖质量分数。在干旱胁迫下，淀粉质量分数的变化表现为褪黑素施加后叶片中含量增加，根中则表现低质量分数胁迫(P10)提高，高质量分数(P20)胁迫降低的现象，说明外源施加褪黑素可能通过调节叶片和根中的可溶性总糖和淀粉的相对含量，维持叶片和根的不同生理功能，研究结果有助于加深理解外源褪黑素通过碳调配机制缓解干旱对长序榆的不利影响。

非结构性碳水化合物的含量可反映植物的碳供给状况，是植物抵御干旱和应对干旱胁迫的生存策略[21]。在干旱胁迫下，非结构性碳水化合物在根、茎、叶中的分配格局是植物对环境适应能力的综合体现[22]。本研究表明，干旱胁迫降低了根、叶中的非结构性碳水化合物质量分数，施加褪黑素提高了干旱胁迫下叶中的非结构性碳水化合物质量分数和中度干旱胁迫下(P10)根中的非结构性碳水化合物质量分数，总碳质量分数在施加褪黑素后根、叶中均有所增加，说明外源褪黑素通过增强干旱胁迫下长序榆叶片的净光合速率以维持叶片的碳源功能，同时把适量的碳源向根转移，使根中的总碳质量分数增加，确保根系的生理代谢功能以吸收更多的水分来适应干旱。

N、P是植物生长发育的重要大量元素，也是蛋白质、核酸等主要大分子物质的结构成分。在正常情况下，植物体内的N、P质量分数及其化学计量关系维持在一个稳定的平衡状态。在干旱胁迫下，植物通过调节碳氮同化、分配和转移，以此适应环境的胁迫[23]。研究表明，施用褪黑素能够促进‘夏黑’葡萄对N和其他微量元素的吸收[24]，从而提高植物对干旱等不良环境的抗性。本研究中，干旱胁迫降低了叶片中N、P质量分数，增加了根中N、P质量分数，表明干旱胁迫会改变N、P在根、叶中的分配，把更多的养分元素转移至根，增强植物对干旱环境的适应。干旱胁迫下喷施褪黑素提高了长序榆叶片对N、P元素的吸收，但却降低了根中N、P质量分数，这有助于叶片正常光合功能的发挥，提高光合效率，增加光合碳物质的积累，缓解干旱胁迫对长序榆的损伤。w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)可以反映植物对N、P的利用效率，在逆境下植物对N、P的利用效率往往高于正常生长情况下的[25]。本研究表明，干旱胁迫下，叶片中的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值均有不同程度的提高，根中w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值则表现相反的情况，说明叶片作为植物的主要光合器官，通过对N、P的高效利用，以积累更多的碳物质用于呼吸等重要的生理过程，保证新陈代谢过程碳物质及能量的供给。在干旱胁迫下施加褪黑素w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值在根、叶呈现不同的变化。叶中的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值在中度干旱胁迫下均表现明显下降的趋势。而重度干旱胁迫下，两者的比值的变化并不明显；在根中，w(C)∶w(N)比值均表现明显增加，C∶P比值则是在中度干旱胁迫下表现增加，而重度干旱胁迫下同样没有明显的变化。本研究结果表明，褪黑素通过调控N、P在根、叶中的分配及各器官对它们的利益效率，调控植物对干旱胁迫的适应。对于褪黑素在代谢组水平及分子水平对干旱调控的作用机制有待于下一步深入研究。

综上所述，干旱胁迫下，长序榆的生长受到不同程度的抑制。叶片喷施褪黑素能通过保护叶绿素，提高净光合速率缓解干旱胁迫对生长的抑制作用；施加褪黑素后调节了根、叶中可溶性糖和淀粉含量的再分配，叶中的N、P质量分数增加，w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值降低，相反，根中的N、P下降，w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值升高，褪黑素施加后通过调节根、叶中N、P的利用效率，缓解干旱胁迫对长序榆的抑制作用。