RAW264.7细胞MyD88基因缺失株构建①

王 燕 陈 为 董明鑫 孙成彪 张剑旭 常 影 刘文森 许 娜③

（中国农业科学院长春兽医研究所，长春 130122）

近年随着“魔剪”CRISPR/Cas9技术崛起，基因编辑在生物医药研究领域掀起了一股研究热潮［1］。与传统基因编辑技术（如锌指核酸酶、活因子样效应物核酸酶等）相比，CRISPR/Cas9技术采用特殊小向导RNA（single guide RNA，sgRNA）靶向目标基因，具有操作简便、靶向效应强等优点，成为当前基因研究领域的有力工具，已广泛用于目的基因筛选编辑和药物靶点筛选等领域［2-3］。髓样分化因子88（myeloid-differentiation primary response protein 88，MyD88）是Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号转导中的重要接头分子，其介导的TLRs信号转导称为MyD88依赖型途径，以形成MyD88、IRAK4和IRAK1复合体为标志，早期活化NF-κB和MAPK为特征［4］。近年研究发现，MyD88不仅在固有免疫中发挥重要作用，还可调控适应性免疫，是连接二者的桥梁，但部分机制尚不明确［5］。为深入开展MyD88功能及相关调控机制研究，本研究拟采用CRISPR/Cas9技术定点敲除MyD88基因，制备MyD88缺失的稳定RAW264.7细胞株。

1 材料与方法

1.1 材料293T细胞株、RAW264.7细胞株、大肠杆菌菌株DH5-α均为本实验室保存；三质粒系统（pSPAX2、pMD2G和穿梭质粒）、pHBLV-U6-gRNAEF1-ZsGreen载体（汉恒）；质粒DNA抽提试剂盒（Axygen）；限制性内切酶、T4连接酶（TaKaRa）；LipofiterTM转染试剂盒、胎牛血清、1640培养液、0.25%胰酶、Puromycin（Life）；RNA提取试剂盒（奕杉）；MyD88抗体（Cell Signaling Technology）；羊抗兔IgG抗体（Proteintech）；Luminata forte western HRP substrate（Merck Millipore）；脂多糖LPS、肽聚糖PGN（Sigma Aldrich）；Mouse TNF-αELISA kit（达优）；CO2细胞培养箱、低温高速离心机（Thermo）；荧光显微镜（Olympus）；荧光定量PCR仪（ABI）；高端凝胶成像系统（Alpha Innotech）；高端多功能酶标仪（TECAN）；参照NCBI中目的基因序列，应用Primer 5.0软件设计引物（表1），引物由上海生工生物公司合成；TNF-α引物购自GeneCopoeia。

1.2 方法

1.2.1 HBLV-Cas9-PURO慢病毒包装和滴度测定将pSPAX2、pMD2G和携带Cas9基因的穿梭质粒进行扩增，经大量高纯度无内毒素抽提后，共转染293T细胞，6 h后更换为完全培养液培养48 h和72 h，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清，4℃、2 000 g离心10 min，去除细胞碎片，收集病毒上清，离心120 min，得到高滴度慢病毒超离液（HBLV-Cas9-PURO）。分装病毒、标记、-80℃保存。稀释计数法测定病毒滴度（TU/ml）=细胞数×阳性克隆百分比×MOI×病毒稀释倍数×103。

1.2.2 HBLV-Cas9-PURO感染、筛选及鉴定感染前1 d将RAW264.7细胞适当铺板，细胞密度生长至30%～50%时，将HBLV-Cas9-PURO以MOI=20进行1/2小体积感染，4 h后补足至完全培养体积，24 h后更换新鲜完全培养液，48 h后荧光显微镜初步观察GFP表达效率并更换含10µg/ml Puromycin的新鲜完全培养液进行Puromycin抗性筛选，进行稳定株筛选及扩增，提取细胞总RNA，PCR检测Cas9基因表达，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。PCR反应条件：94℃10 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，30个循环。

1.2.3 m-MyD88 gRNA重组载体构建和慢病毒包装根据小鼠MyD88在NCBI的基因序列，为实现CRISPR/Cas9打靶载体用于小鼠MyD88基因敲除，设计3条sgRNA序列：m-MyD88 gRNA1、m-MyD88 gRNA2、m-MyD88 gRNA3（表2），由长春库美公司合成后，退火成双链Oligo序列，T4连接酶接入含ZsGreen荧光标记的pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen线性化表达载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，Amp抗性平板培养过夜，挑菌并扩大培养，菌液进行测序。将测序验证正确的阳性克隆进行质粒提取和慢病毒包装，慢病毒（HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA2-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP和HBLV-GFP NC对照）包装及滴度测定方法同1.2.1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 sgRNA寡核苷酸序列Tab.2 Sequences of sgRNA oligonucleotides

1.2.4 HBLV-m-MyD88 gRNA-GFP感染及基因敲除效果鉴定筛选成功的RAW264.7-Cas9细胞以5×105个/ml铺于6孔板，待细胞密度生长至30%～50%融合时，将包装的各组慢病毒以MOI=30进行1/2小体积感染，感染后筛选过程及PCR鉴定方法同1.2.2。同时进行Western blot鉴定，提取感染后的RAW264.7-Cas9细胞蛋白，BCA定量后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转至PVDF膜，5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1 h，加入抗MyD88抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜，PBST洗膜3次，5 min/次，加入二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次，滴加发光液，高端凝胶成像系统检测MyD88表达。

1.2.5 MyD88基因敲除后TNF-α表达检测为验证敲除MyD88基因的RAW264.7细胞功能，采用MyD88基因激活剂LPS和PGN诱导敲除MyD88基因的RAW264.7细胞8 h，收集上清，ELISA试剂盒检测TNF-α分泌情况；提取细胞总RNA、逆转录、荧光定量PCR检测TNF-α表达。

1.3 统计学处理采用SPSS17.0软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒滴度测定采用稀释计数法对构建的慢病毒HBLV-Cas9-PURO、HBLV-GFP NC对照、HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA2-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP进行滴度测定，测定结果见表3。

2.2 RAW264.7-Cas9细胞株鉴定将HBLV-Cas9-PURO感染并筛选后的细胞进行扩增，提取正常组和感染后的RAW264.7-Cas9细胞RNA，PCR检测Cas9基因表达。与正常RAW264.7细胞比较，感染后Cas9基因扩增产物表达升高（图1），表明获得稳定表达Cas9基因的RAW264.7细胞（RAW264.7-Cas9）。

表3 慢病毒滴度测定结果Tab.3 Results of lentivirus titer determination

2.3 gRNA重组载体测序结果 将单链sMyD88-gRNAs退火成双链Oligo序列，连接入单酶切线性化的载体pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen。转化子由上海汉恒生物科技公司进行测序（图2），插入序列位置和方向与预期相符，证明3个载体构建成功。

2.4 RAW264.7-Cas9细胞感染及敲除效果鉴定各组慢病毒分别感染RAW264.7-Cas9后，荧光显微镜下观察gRNA重组载体导入情况，结果显示目的基因导入成功（图3）。PCR检测各组细胞MyD88基因表达，与对照组比较，HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后RAW264.7-Cas9细胞MyD88基因表达显著下调（图4A）。为进一步验证敲除效果，采用Western blot检测MyD88蛋白表达，结果显示，HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP和HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后细胞MyD88蛋白表达均下降，且HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组下降最为显著（图4B）。说明MyD88基因敲除成功，gRNA3组敲除效果最佳。

图1 Cas9基因PCR结果Fig.1 PCR analysis of Cas9 gene

图2 MyD88-gRNA测序图Fig.2 Sequencing data of MyD88-gRNA

图3 荧光显微镜下视野（×10）Fig.3 Field of vision under fluorescence microscope（×10）

图4 MyD88基因敲除后PCR扩增产物及蛋白表达Fig.4 Expressions of PCR products and protein after MyD88 gene knockout

图5 MyD88基因敲除后TNF-αmRNA表达Fig.5 Expression of TNF-αmRNA after MyD88 knock down

图6 MyD88基因敲除后细胞上清TNF-α分泌水平Fig.6 Secretion level of TNF-αafter MyD88 knock down

2.5 MyD88基因敲除后TNF-α水平检测 采用MyD88基因激活剂LPS（50 ng/ml）和PGN（20µg/ml）诱导RAW264.7和gRNA3组细胞8 h后，荧光定量PCR和ELISA检测TNF-α表达与分泌水平，结果显示，与诱导后正常RAW264.7细胞比较，敲除MyD88基因后TNF-α表达和分泌水平均下调（P＜0.05，图5、6）。

3 讨论

基因编辑技术是一种人为对目的基因片段进行基因敲除、特异突变引入或定点转基因修饰的技术［6］。CRISPR/Cas9技术因高效、特异、操作简易、周期短等优点，逐渐成为目前基因编辑的主流，在生物学领域取得广泛进展，并于2020年被授予诺贝尔化学奖［7］。CRISPR/Cas9系统通过sgRNA引导Cas9蛋白结合于基因外显子区，Cas9蛋白对DNA双链进行切割，通过非同源性末端连接导致随机碱基插入/缺失，导致基因发生移码突变，达到基因敲除目的［8］。本研究首先采用慢病毒感染方法获得稳定表达Cas9的RAW264.7细胞，构建及合成MyD88基因的sgRNA，采用慢病毒感染方式将sgRNA导入稳定表达Cas9的RAW264.7细胞，最终敲除RAW264.7细胞中的MyD88基因。

TLRs属于膜型模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），是单个跨膜非催化性蛋白，主要表达于单核-巨噬细胞、NK细胞、B淋巴细胞及树突状细胞等，由富含亮氨酸重复单位的胞外结构域、跨膜结构域和胞内Toll-白介素1受体（Toll-interleukin 1 receptor，TIR）结构域组成，而TIR的功能是募集下游接头分子转导信号［9］。MyD88蛋白是第一个被发现的TLRs接头分子，其结构也为三部分：N端的死亡结构域（death domain，DD）、中间区域及C端的Toll区［10］。NF-κB是MyD88下游的关键转录因子，通常以p65和p50异二聚体形式存在，细胞静息状态下由于抑制蛋白IKβ结合，致使NF-κB滞留于细胞质，无法调控相关基因转录［11］。当TLRs与配体结合时，TIR与MyD88的C端Toll区形成复合体，引起DD结构域活化，募集IRAK1、IRAK4和TRAF6，TRAF6活化并激活TAK-1，使IKK（IKβkinase）磷酸化。磷酸化的IKK可催化IKβ泛素化降解，解除其对NF-κB的抑制，NF-κB由胞质进入胞核作用于反应原件，启动一系列特定基因转录表达，产生细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6等［12］。ADACHI等［13］对MyD88基因敲除的小鼠腹腔注射高剂量LPS，小鼠可存活96 h以上。本研究构建的稳定敲除MyD88基因的RAW264.7细胞株经LPS和PGN诱导后，TNF-α表达明显受抑制，与既往研究结果一致。

最新研究表明，MyD88在固有免疫和适应性免疫中均发挥作用，对自身免疫疾病、炎症性疾病、感染性疾病和过敏性疾病等均有调控效应，但机制尚需进一步探究［14］。本研究采用CRISPR/Cas9系统，借助慢病毒感染方法，成功构建RAW264.7细胞MyD88基因缺失株，可为深入探寻MyD88基因作用提供重要载体。