miR-212通过靶向NRP1调节结肠癌SW480肿瘤干细胞样特性和免疫应答①

李 辰 张天锋 闻 愚 王云龙 包武阳

（南阳医学高等专科学校第一附属医院普外1科，南阳 473058）

结肠癌（colon cancer，CC）是常见的消化道恶性肿瘤，发病率和致死率极高，早期不易被发现，晚期无特效治疗药物，严重威胁人类生命健康［1］。神经纤毛蛋白1（neuropilin-1，NRP1）是血管内皮生长因子家族成员的共同受体，对肿瘤血管新生、肿瘤生长及转移性传播具有重要作用。研究表明，NRP1在肺癌、胰腺癌、CC等多种癌症中高表达［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是由一段长度为20～24个碱基组成的内源性非编码小RNA，可与靶向基因的3"UTR区域配对结合，抑制目标mRNA和蛋白表达，参与靶向基因表达的调控［3］。研究表明，miRNA具有多种生物学功能，在肿瘤增殖和转移过程中发挥重要作用，可作为肿瘤治疗的潜在靶点［4-5］。miR-212是miRNA中的一员，定位于人17号染色体，在肺癌细胞、骨髓瘤细胞、结直肠癌细胞等多种肿瘤细胞中发挥调控作用［6-7］。但miR-212在CC中的研究鲜见报道，因此，本文通过RT-PCR检测miR-212在SW480细胞中的表达水平，利用生物信息学手段预测miR-212的靶基因NRP1，并以荧光素酶实验进行验证，检测miR-212对NRP1表达水平的影响，初步阐明miR-212调控CC SW480肿瘤干细胞样特性和免疫应答的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料人CC细胞SW480购自中国科学院细胞库。胎牛血清（FBS）、胰酶和RPMI1640培养基购自美 国Gibco公 司；miR-212-5p、miR-NC、pcDNANRP1购自美国Ambion公司；Trizol试剂和转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒及实时定量PCR荧光染料Sybergreen购自TaKaRa生物有限公司；荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；一抗、二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将细胞转移至无菌离心管，加入含10%FBS的RPMI1640培养基，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入细胞培养液悬浮细胞，接种至细胞培养板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后换液，细胞融合度达到85%左右时进行传代。

1.2.2 细胞转染取生长至对数期的SW480细胞，加入胰酶消化，待消化完全后将细胞转移至新的离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入不含胎牛血清的不完全培养基接种至培养板，37℃、含5%CO2的培养箱中培养，待细胞融合度在60%～70%时，将miR-NC（miR-NC组）、miR-212-5p（miR-212-5p组）、pcDNA-NRP1（NRP1组）、miR-212-5p+pcDNA-NRP1（miR-212-5p+NRP1组）与不完全培养基混合后加入SW480细胞，接种至24孔板表面，37℃、含5%CO2的培养箱中培养48 h，RT-PCR检测miR-212-5p和NRP1 mRNA表达水平，Western blot检测NRP1蛋白表达水平。

1.2.3 荧光素酶实验TargetScan靶基因预测软件预测miR-212-5p可能的靶基因，结果显示，NRP1可能是其下游靶基因。提示NRP1 mRNA的3"UTR位点2 092～2 099是miR-212-5p的结合位点，体外合成该位点DNA片段，克隆至双荧光素启动子载体Luc-NRP1 3"UTR wt和Luc-NRP1 3"UTR mut。将hsa-miR-212-5p与Luc-NRP1 3"UTR wt和Luc-NRP1 3"UTR mut共同转染至SW480细胞，培养48 h，荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。

1.2.4 流式分选收集贴壁培养的SW480细胞，PBS洗2～3次，100µl流式细胞分选技术缓冲液重悬，设立miR-NC组（miR-NC组）、miR-212-5p组（miR-212-5p组）、pcDNA-NRP1组（NRP1组）、miR-212-5p+pcDNA-NRP1组（miR-212-5p+NRP1组），对照组加入CD44-PE和CD44-FTTC单阳性对照，阴性对照组加入相应抗体，实验组加入CD44-PE和CD44-FTTC，于4℃下避光孵育，每隔10 min混悬1次细胞，0.5 h后用流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot使用胰酶消化细胞，采用RIPA蛋白裂解液于冰上提取总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，加入一抗（SOX2、LGR5），4℃孵育摇床过夜。回收一抗，加入按比例稀释的HRP标记的对应二抗，室温孵育120 min。采用ECL化学发光法于暗室下曝光显影（GAPDH作内参）。将胶片进行扫描存档，Photoshop整理去色，Alpha软件分享光密度值，实验重复3次。

1.2.6 ELISA转染SW480细胞于4℃、1 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定TNF-α、IL-6、IL-4含量。

1.2.7 RT-PCR将细胞样品用液氮研磨成粉末，Trizol法提取总RNA，检测RNA浓度和纯度，根据逆转录试剂盒说明书反转录为cDNA。PCR反应条件：95℃5 min，95℃10 s，60℃5 s循环40次。各引物序列：hsa-miR-212-5p正向引物5"-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3"，反向引物5"-ACCTTGGCTCTAGACTGCTTACT-3"；pc-DNA-NRP1正向引物5"-CCCCAAACCACTGATAACTCG-3"，反向引物5"-AGACACCATACCCAACATTCC-3"；GAPDH正 向引物5"-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3"，反向引物5"-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3"；U6正向引物5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，反向引物5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。以目的基因和GAPDH或U6比值表示mRNA或miRNA表达水平，采用ΔΔCt法分析结果，实验重复3次。

1.3 统计学分析使用SPSS17.0软件分析数据。符合正态分布的计量资料表示为±s。多组数据比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-212-5p抑制NRP1表达与空白对照组（Control组）相比，阴性对照组（miR-NC组）miR-212-5p和NRP1表达水平无明显差异，转染miR-212-5p可显著上调SW480细胞中miR-212-5p水平，下调NRP1 mRNA水平（P＜0.05），见图1。提示miR-212-5p抑制SW480细胞NRP1表达。

2.2 miR-212-5p靶向基因NRP1的验证生物信息学网站预测miR-212-5p靶向NRP1基因，荧光素酶实验对其进行验证，结果如图2A所示，has-miR-212-5p可与基因NRP1 3"URT区结合。miR-212-5p抑制野生型Luc-NRP1 3"UTR荧光素酶活性，而当靶点发生突变时，miR-212-5p不具有抑制作用（图2B）。提示NRP1是miR-212-5p的靶向基因。

图1 miR-212-5p对SW480细 胞miR-212-5p和NRP1 mRNA表达的影响Fig.1 Effects of miR-212-5p on expressions of miR-212-5p and NRP1 mRNA in SW480 cells

图2 荧光素酶实验验证miR-212-5p靶向NRP1基因Fig.2 Luciferase experiment verifies miR-212-5p targeting NRP1 gene

2.3 miR-212-5p对NRP1表达的影响 与Control组相比，转染miR-212-5p后，SW480细胞中miR-212-5p水平明显升高，NRP1 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与NRP1组相比，联合转染miR-212-5p和pcDNA-NRP1后，miR-212-5p水平明显升高（P＜0.05），NRP1 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），见图3。结果再次说明miR-212-5p可抑制NRP1的表达。

2.4 miR-212-5p调节SW480肿瘤干细胞样特性流式细胞术筛选干细胞阳性标记（CD44），结果显示，与Control组相比，miR-212-5p显著下调CD44+阳性比例（P＜0.05），NRP1上调CD44+比例（P＜0.05）；与NRP1组相比，转染miR-212-5p+NRP1后，CD44+明显被抑制（P＜0.05），见图4A。Western blot检测干细胞标志物SOX2和LGR5蛋白表达，与Control组相比，SW480细胞转染miR-212-5p后，SOX2和LGR5蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与NRP1组相比，联合转染miR-212-5p+NRP1后，SOX2和LGR5蛋白表达明显降低（P＜0.05），见图4B。提示miR-212-5p通过靶向NRP1调节SW480肿瘤干细胞样特性。

2.5 miR-212-5p调节SW480细胞免疫应答与Control组相比，转染miR-212-5p可显著上调促炎因子IL-6和TNF-α表达（P＜0.05），下调抗炎因子IL-4表达（P＜0.05）。与NRP1组相比，联合转染miR-212-5p和NRP1后，IL-6和TNF-α表达明显上调（P＜0.05），IL-4表达下调（P＜0.05），见图5。结果说明miR-212-5p通过靶向NRP1调节SW480细胞的免疫应答。

图3 miR-212-5p对NRP1表达的影响Fig.3 Effect of miR-212-5p on expression of NRP1

图4 miR-212-5p调节SW480肿瘤干细胞样特性Fig.4 miR-212-5p regulates tumor stem cell-like properties of SW480

图5 SW480肿瘤干细胞中免疫调节因子表达水平Fig.5 Expression levels of immunoregulatory factors in SW480 tumor stem cells

3 讨论

CC的发生发展依赖于癌基因与抑癌基因等多种因素的共同作用，其机制复杂多变［8］。因此，探寻CC的发病机制和关键调控因子对其临床上的诊断和治疗具有重要意义。miRNA通过与靶基因的mRNA结合调节基因表达，发挥抑癌基因作用［9］。研究发现，miR-212在人类肿瘤发生发展过程中发挥重要调控作用，miR-212通过靶向SOX4 mRNA的3"UTR区抑制结直肠癌迁移、侵袭和EMT过程，miR-212通过靶向TBX15抑制透明细胞肾细胞癌的恶性行为，miR-212通过靶向c-Met促成垂体腺瘤细胞异常增殖和侵袭等［10-14］。NRP1在多种肿瘤细胞功能和肿瘤细胞微环境中发挥作用，是肿瘤发生发展的重要促进因子［15］。NRP1作为NRP家族成员，主要表达于血管内皮组织，与血管内皮生长因子（VEGF）相互作用调节肿瘤细胞的侵袭和增殖，促进肿瘤细胞炎症反应、免疫应答和干细胞增殖过程［16-17］。

本研究通过TargetScan靶基因预测软件预测miR-212的靶基因，并检测miR-212对NRP1表达的影响，探究miR-212是否通过靶向调控NRP1的表达在CC中发挥调节作用。结果发现，NRP1是miR-212的靶基因，转染miR-212可显著抑制NRP1 mRNA和蛋白表达。提示miR-212可能通过靶向抑制NRP1的表达在CC中发挥调节作用。

肿瘤干细胞是肿瘤恶化的标志性细胞，具有无限增殖和自我更新的能力，在肿瘤细胞侵袭、转移和增殖过程中发挥重要作用。SOX2是维持胚胎干细胞和神经干细胞样特性的转录因子，研究表明，SOX2可能通过促进细胞凋亡蛋白caspase-3和caspase-9表达维持肿瘤干细胞干性［18］。LGR5是G蛋白偶联受体家族成员，具有自我更新和多向分化潜能，通过参与调控Wnt/β-catenin信号通路在多种肿瘤的发生发展过程中发挥作用［19］。本研究通过流式细胞术分选干细胞阳性标记CD44阳性比例，免疫印迹检测SOX2和LGR5蛋白表达水平，结果发现，细胞转染miR-212后，CD44+比例、SOX2和LGR5蛋白表达明显减少，同时，因NRP1上调的SOX2和LGR5蛋白表达也被miR-212抑制。提示miR-212通过靶向调控NRP1表达调节SW480肿瘤干细胞样特性。

炎症反应和免疫应答是肿瘤恶化程度的重要指标，炎症反应产生的炎症细胞和免疫抑制因子会破坏免疫系统的稳定，使机体正常细胞免疫系统紊乱并最终走向死亡［20］。IL-6、TNF-α、IL-4是细胞炎症和免疫反应的重要调控因子，研究表明，在肿瘤细胞的发生发展过程中，IL-6和TNF-α表达量增加可诱导肿瘤细胞发生炎症反应［21］。本研究检测肿瘤细 胞 上清液中IL-6、TNF-α、IL-4蛋白含 量和mRNA表达水平，结果发现，转染miR-212可显著上调IL-6和TNF-α表达，下调IL-4 mRNA和蛋白表达，联合转染miR-212和NRP1可明显抑制NRP1对肿瘤细胞免疫应答的保护作用。提示miR-212通过靶向抑制NRP1的表达调节SW480细胞免疫应答，并进一步诱导CC细胞死亡。

综上所述，miR-212可能通过靶向抑制NRP1表达，调节SW480肿瘤干细胞样特性和免疫应答。本研究从细胞水平初步探究miR-212在SW480肿瘤干细胞样特性和免疫应答中的调节作用，后续实验研究组计划构建移植瘤动物模型，进一步探讨miR-212在体内的作用。