沉默miR-8063促进结直肠癌细胞获得多药耐药性及机制研究①

袁 涛 王 林 陈正权 文坤明（遵义医科大学附属医院普通外科，遵义 563003）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的第二大原因［1］。以化疗为主的综合治疗是复发及转移性结直肠癌的主要治疗手段。随着化疗方案逐渐完善，越来越多化疗药物在临床上被广泛使用，而化疗过程中对这些化疗药物产生的多药耐药（multidrug resistance，MDR）成为化疗失败的主要原因之一［2］。因此，深入研究产生耐药性的潜在机制并寻求针对性治疗靶点，对提高CRC生存率及改善预后具有重要意义。本课题组前期研究已证实Oct4B1作为一种癌基因能够促进CRC细胞对奥沙利铂的耐药性［3］。为研究Oct4B1调控CRC耐药性的分子机制，课题组采用miRNA芯片筛选出与Oct4B1表达趋势相反的miRNA，并从中找到表达差异最为显著的miR-8063，推测miR-8063可能作为一种抑癌基因在调节CRC耐药性中发挥重要作用。本研究采用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术在CRC细胞SW480、HT29中沉默miRNA-8063基因，观察沉默miRNA-8063是否能够促进CRC细胞获得MDR，并探讨其分子机制是否与激活WNT/β-catenin信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 材料人结CRC细胞系SW480、HT29购自上海中科院细胞库；沉默miR-8063慢病毒载体（miR-8063-inhibitor-GFP-PURO）及阴性对照病毒（NCGFP-PURO）委托上海汉恒生物科技有限公司构建；培养SW480细胞的L-15培养基、培养HT29细胞的5A培养基及胎牛血清（FBS）购自美国HyClone公司；2.5%胰酶、细胞全蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；RT-qPCR试剂盒和逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；CCK-8试剂购自美国MedChemexpress（MCE）公司；奥沙利铂（OXA）和5-氟尿嘧啶（5-FU）购自美国Sigma公司；兔抗人P-gp、ABCG2、WNT3A、WNT5A、β-catenin一抗购自美国Proteintech公司；鼠抗人GAPDH和β-tubulin一抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔/鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒转染SW480、HT29细胞分别转染沉默miR-8063基因的慢病毒（miR-8063-inhibitor-GFP-PURO）和阴性对照病毒（NC-GFP-PURO）。沉默miR-8063基因慢病毒序列为：5"-UUCGGGGCUGAGGACUAAAACU-3"。转染前1 d将两种细胞用0.25%胰酶消化并按1×105个/孔接种于24孔板；采用阴性对照病毒确定各组细胞转染条件，确定MOI值，根据MOI值计算每孔所需病毒量，病毒体积=（MOI×细胞数目）/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/ml，2.5µl/孔加入Polybrene（2 mg/ml），最后加入对应培养基补充体积至500µl/孔，48 h后更换新鲜培养基，72 h后倒置显微镜下观察荧光并拍照，收集细胞，RT-qPCR鉴定转染病毒后miR-8063基因的沉默效果。

1.2.2 miR-8063基因沉默效果检测转染72 h后，采用RT-qPCR检测两组细胞miR-8063相对表达（以U6为内参，具体步骤见1.2.4），引物由大连宝生物有限公司设计合成，引物序列见表1。

1.2.3 CCK-8检测5-FU和OXA对细胞增殖的影响SW480和HT29细胞消化并计数，以每孔1×104个/100µl接种于96孔板培养24 h，加入0、2、4、8、16、32、64、128µg/ml梯度浓度的5-FU和OXA，室温作用72 h，10µl/孔加入CCK-8溶液，37℃孵育3 h，酶标仪读取每孔450 nm处吸光度（OD）值，计算出药物作用72 h时半数抑制浓度（IC50）。将实验组和对照组细胞按照上述方法接种于96孔板，加入5-FU和OXA（根据上述计算出的IC50加入），设置24 h、48 h和72 h 3个检测点，检测前3 h 10µl/孔加入CCK-8溶液在37℃培养箱内孵育，酶标仪测定450 nm处OD值，每组设3个复孔，实验重复3次，细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

1.2.4 RT-qPCR检测耐药基因P-gp、ABCG2 mRNA表达按照说明书采用Trizol试剂提取总RNA，酶标仪测量其浓度。取0.8µg总RNA按照PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA，SYBR Green染料法进行实时PCR，总反应体积为20µl。反应条件：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40个循环；95℃15 s，60℃60 s，90℃15 s。每次检测设3个复孔，实验重复3次。以GAPDH为 内 参，2-ΔΔCt法确定目的基因mRNA表达（引物序列见表1）。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达收集细胞，按照蛋白提取试剂盒明书和BCA蛋白浓度测定试剂盒步骤提取蛋白，测定蛋白浓度；取待测样品中40µg总蛋白，根据目的蛋白分子量在相应浓度的凝胶上分离目的蛋白，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，将膜与对应一抗稀释液（1∶2 000）4℃孵育过夜，第2天用1×TBST洗涤3次，加入对应的HRP标记羊抗兔/鼠IgG二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，1×TBST洗 涤 膜3次，将 膜 置 于ECL发光 液2 min，X射线胶片曝光显现蛋白条带，扫描，Quantity-One软件分析，目的蛋白相对表达=目的蛋白灰度值/内参GAPDH蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析采用SPSS17.0及GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析和制图。数据以±s表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒转染SW480、HT29细胞效果SW480、HT29细胞分别感染miR-8063-inhibitor-GFP-PURO和NC-GFP-PURO，转染72 h后荧光倒置相差显微镜下可见绿色荧光（图1），表明病毒转染成功。

2.2 RT-qPCR检测两组细胞miR-8063表达RTqPCR结果显示，SW480-sh-NC和SW480-sh-miR-8063两组细胞miR-8063表达分别为1.05±0.06和0.40±0.03；而HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063两组miR-8063表达分别为1.04±0.08和0.23±0.03，与阴性对照组相比，实验组miR-8063表达显著降低（P＜0.01，图2）。表明miR-8063在SW480和HT29中被成功沉默。

2.3 CCK-8法检测两组细胞对化疗药物5-FU和OXA的敏感性GraphPad Prism 5.0软件计算出5-FU和OXA两种化疗药物对SW480细胞72 h的IC50分别为52.09和16.20µg/ml，两种药物对HT29细胞72 h的IC50分别为57.59和22.63µg/ml（图3）。24 h、48 h、72 h时5-FU对SW480-sh-NC、SW480-shmiR-8063、HT29-sh-NC、HT29-sh-miR-8063细胞的增殖抑制率分别为（15.86±1.15）%、（13.73±1.53）%、（13.54±0.88）%、（11.23±1.12）%；（29.52±1.79）%、（18.71±2.43）%、（23.44±2.73）%、（15.94±2.06）%；（71.93±5.22）%、（41.53±3.67）%、（50.38±3.91）%、（32.16±2.58）%。OXA在24 h、48 h、72 h对上述细胞的增殖抑制率分别为（11.24±1.77）%、（10.24±1.03）%、（10.75±0.98）%、（7.54±1.52）%；（26.49±3.54）%、（14.87±2.66）%、（27.58±2.32）%、（11.04±3.14）%；（80.76±4.02）%、（54.66±3.21）%、（64.38±3.31）%、（42.48±2.69）%。提示沉默miR-8063后SW480和HT29细胞对5-FU和OXA两种化疗药物的敏感性均随着药物作用时间延长而降低，相较于对照组，实验组48 h和72 h的增殖抑制率显著降低（P＜0.01，图4），表明48 h和72 h两时间段实验组细胞对5-FU和OXA均产生了耐药性，提示实验组细胞获得MDR。

2.4 RT-qPCR检测两组细胞中耐药基因P-gp、ABCG2 mRNA表达RT-qPCR结果显示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063细胞P-gp mRNA表达分别为1.05±0.05、1.81±0.05、1.02±0.11和2.50±0.09；ABCG2 mRNA在上述四组细胞相对表达分别为0.98±0.06、1.58±0.06、0.98±0.04和2.01±0.07。与对照组相比，实验组中p-gp mRNA表达分别提高1.8倍和2.5倍；ABCG2 mRNA表达则分别提高1.6倍和2.0倍（P＜0.01，图5）。

图2 RT-qPCR检测miR-8063表达Fig.2 Expression of miR-8063 detected by RT-qPCR

图3 不同药物浓度作用于SW480、HT29细胞的增殖抑制率（72 h）Fig.3 Cytotoxic effects of different drug concentration on SW480 and HT29 cells（72 h）

图4 不同时间点（24 h、48 h、72 h）5-FU和OXA在两组细胞中的增殖抑制率Fig.4 Cell proliferation inhibition rates of 5-FU and OXA at different time points（24 h，48 h and 72 h）in experimental group and control group

图5 RT-qPCR检测P-gp和ABCG2 mRNA表达Fig.5 mRNA levels of P-gp and ABCG2 detected by RTqPCR

2.5 Western blot检测两组细胞耐药基因P-gp、ABCG2蛋白表达Western blot结果显示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063细胞P-gp蛋白表达分别为0.29±0.04、0.53±0.05、0.33±0.05和0.55±0.04；ABCG2蛋白上述四组细胞中相对表达分别为0.20±0.06、0.69±0.03、0.26±0.05和0.71±0.04。实验组P-gp和ABCG2蛋白相对表达均显著高于对照组（P＜0.01，图6）。

2.6 Western blot检测两组细胞WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表达Western blot结果显示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063组细胞WNT3A表达分别为0.08±0.01、0.18±0.01、0.12±0.02和0.23±0.03；WNT5A在以上四组细胞的相对表达分别为0.13±0.03、0.32±0.03、0.20±0.01和0.39±0.02；β-catenin在以上四组细胞的相对表达量分别为0.14±0.03、0.25±0.02、0.18±0.02和0.31±0.04。与对照组相比，实验组WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表达显著升高（P＜0.01，图7）。

图6 Western blot检测P-gp和ABCG2蛋白表达Fig.6 Protein levels of P-gp and ABCG2 detected by Western blot

图7 Western blot检测WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表达Fig.7 Protein levels of WNT3A，WNT5A，β-catenin detected by Western blot

3 讨论

CRC是发病率和病死率均较高的恶性肿瘤，对化疗药物MDR已成为CRC化疗成功的主要障碍。MDR的产生是一个多因素共同参与的复杂过程，与减少药物摄取并增强药物外排、限制肿瘤细胞内药物蓄积、阻断细胞凋亡、DNA损伤修复及细胞周期和检查点调节改变等密切相关［4］。尽管关于MDR的研究取得了一定进展，但对恶性肿瘤中MDR产生的具体分子机制仍知之甚少，因此，深入研究MDR的机制、寻求克服MDR的方法、提高化疗药物疗效已成为目前肿瘤治疗亟待解决的问题。microRNAs是一类长度约为18～25个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，通过结合不完全的3"UTR非翻译区靶基因mRNA导致mRNA降解或翻译抑制，从而在转录后对靶基因表达实施调控［5-6］。研究表明，microRNAs异常表达在多种恶性肿瘤MDR调控中发挥重要作用［7-9］。本研究利用前期基因芯片筛选结果，以CRC细胞SW480、HT29为研究对象，采用慢病毒介导的RNAi技术沉默其miR-8063基因，探究是否能够促进SW480、HT29细胞获得MDR，及其机制是否与激活WNT/β-catenin信号通路有关。

5-FU和OXA是目前转移性CRC一线化疗方案的常用药物［10］。本研究中，实验组在48 h和72 h的增殖抑制率较对照组明显降低（P＜0.01），表明48 h和72 h两个时间段实验组细胞对5-FU和OXA均产生了耐药，提示沉默miR-8063基因促进SW480、HT29细胞获得了MDR。研究证实肿瘤细胞获得MDR与细胞膜表面ATP结合盒转运蛋白（ATPbinding cassette transporter，ABC转运蛋白）介导的药物转运系统改变密切相关，其中P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和ATP结合盒式转运蛋白亚家族成员G2（ATP binding cassette transporter，subfamily G member 2，ABCG2）在MDR中起关键作用［11-13］。这些蛋白能够依赖ATP产生的能量将进入细胞内的药物反泵出细胞，导致细胞内药物浓度降低，从而保护细胞免受细胞毒性药物损伤［14］。与对照组相比，实验组P-gp mRNA相对表达分别提高了1.8倍和2.5倍，ABCG2 mRNA相对表达则分别提高了1.6倍和2.0倍（P＜0.01）。同时，实验组P-gp和ABCG2蛋白表达也较对照组显著增高（P＜0.01），提示沉默miR-8063基因后细胞获得MDR，与其增强耐药基因P-gp和ABCG2表达有关。

WNT/β-catenin信号通路（也称为经典WNT通路）是由WNT家族分泌蛋白、包膜受体Frizzled家族、低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）家族、Disheveled蛋白、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白、支架蛋白（Axin）、酪蛋白激酶（CK1）、β-catenin及TCF/LEF家族转录调节因子等构成［15］。当WNT/β-catenin信号通路被激活时，WNT分泌蛋白与Frizzled受体和LRP5/6蛋白结合，活化Disheveled蛋白，从而使β-catenin降解复合体向质膜募集，导致β-catenin不能被磷酸化并在细胞质中积累，进而易位至细胞核结合转录因子TCF/LEF家族从而诱导靶基因转录［16］。大量研究已证实WNT/β-catenin信号通路异常激活与包括CRC在内多种恶性肿瘤复发、转移、MDR等恶性生物学行为密切相关［17-21］。据报道WNT/β-catenin信号通路在约80%CRC患者中发生突变，提示其作为CRC治疗靶点具有巨大潜力［22］。

microRNAs通过调节WNT/β-catenin信号通路相关蛋白表达在肿瘤中发挥促癌或抑癌作用：JIANG等［23］研究发现miR-30-5p抑制CRC CSCs干性和耐药性，其机制为通过靶向泛素特异性肽酶22（Ubiquitin-specific peptidase 22，USP22）并通过WNT/β-catenin信号 通路实现的。YOU等［24］研究 发 现miR-766-3p在肝细胞癌（HCC）组织中表达下调，且miR-766-3p低表达与HCC TNM分期、转移和不良预后显著相关，过表达miR-766-3p促进了HCC增殖、迁移和侵袭，其机制与miR-766-3p靶向WNT3A并抑制其表达有关。LI等［25］研究也证实miR-26a-5p可通过靶向WNT5A抑制胃癌细胞增殖和侵袭。本研究通过Western blot检测了两组细胞WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表达，结果显示，实验组WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表达较对照组显著升高（P＜0.01），提示沉默miR-8063基因导致了WNT/β-catenin信号通路激活，从而促进SW480、HT29细胞获得MDR。

综上，本研究显示沉默miR-8063基因可促进CRC细胞耐药基因P-gp、ABCG2表达，使CRC细胞SW480和HT29获得MDR，其分子机制可能与激活WNT/β-catenin信号通路有关，为miR-8063在临床上用于CRC分子靶向治疗提供了依据。但本研究仅在体外细胞水平证实miR-8063对CRC细胞MDR的影响，体内功能验证及MDR和WNT/β-catenin信号通路的具体调控机制还需进一步研究。