萝卜细胞质雄性不育性遗传机制及其利用研究进展

柳李旺,李冰霜,董俊辉,张晓莉,王燕,徐良

(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺学院,江苏 南京 210095)

萝卜(RaphanussativusL.)是十字花科萝卜属一、二年生草本植物,营养价值丰富,食疗价值高,是人们喜爱的重要根菜类蔬菜作物。细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)在植物界普遍存在,是由于线粒体功能障碍而阻止功能性花粉产生的一种母系遗传现象,且通常与线粒体基因组的重排有关[1-2]。由于重排和非同源末端连接(NHEJ)活动导致形成新的开放阅读框基因(orf,不育基因),这些基因通常与已知的线粒体基因形成嵌合结构,并编码具有跨膜结构域的蛋白质[3-4]。这种新的嵌合ORF的积累通常导致CMS,使花粉粒发育异常[1,5]。核编码的育性恢复基因(Rf)所编码的蛋白可以靶向线粒体并与CMS不育基因相互作用,通过基因转录、蛋白质翻译等分子水平的不同机制来抑制CMS不育基因的表达,以补偿线粒体功能障碍来恢复育性[6-7]。CMS在植物界广泛存在,目前已在水稻、玉米和高粱等200余种高等植物中观察到CMS现象[3,8]。

萝卜作为异花授粉植物,杂种优势显著,CMS制种可以有效提高种子遗传纯度,有利于萝卜一代杂交种子的商业化生产[9]。因此,CMS在作物遗传育种与F1杂种优势利用中具有重要实践价值,对CMS/Rf系统深入研究也有助于揭示细胞核-质互作这一生命现象。

1 萝卜雄性不育的类型与起源分布

目前12个萝卜线粒体基因组(mtDNA)已经测序,包括4个不育胞质:MS-gensuke(NCBI 登录号:AB694744.1,258 426 bp)[10]、Dongbu(KC193578.1,239 186 bp)[11]、YB-A(MN056360,239 195 bp)[12]和Brassicanapus(Ogura,258 473 bp)[13];8个可育胞质:Uchiki-gensuke(AB694743.1,244 036 bp)[10]、Uchiki-gensuke OS40-type(AP012991.1,259 201 bp)[14]、Black radish(AP012990.1,239 208 bp)[14]、Aonaga(AP013077.1,239 717 bp)[14]、WK10039(KJ716484.1)[15]、YB-B(MN056359,239 725 bp)[12]、Chuanxinhong(JQ083668.1,239 723 bp)[16]、RS41(258 463 bp)[17]。萝卜CMS不育胞质线粒体结构与正常胞质不同。不育胞质mtDNA发生重排,形成新的嵌合蛋白或干扰某些相关基因的正常表达,影响花粉发育,从而导致败育[8,18]。目前研究报道的萝卜CMS不育胞质主要有Ogura、Kos、NWB和DCGMS等类型。

1.1 Ogura CMS

Ogura CMS是由日本学者Ogura于1968年在日本鹿儿岛野生萝卜中首先发现的不育胞质类型,因其败育彻底、育性易恢复,是至今分子机制研究中最充分和育种实际应用最广泛的胞质类型,现已通过属间杂交和体细胞融合等技术转育到其他十字花科作物中。Ogura CMS主要表现为无可见花粉粒、花蕾瘦小、花药未发育完全或皱缩[19]。转录表达分析发现Ogura不育株中orf138和orf158共转录,产生1个1.4 kb的转录本,而可育株中只检测到orf158转录本,表明orf138是引起不育的重要因子[20]。orf138编码一个19×103蛋白,并在线粒体膜上积累[21]。一旦orf138mRNA翻译被阻止,ORF138蛋白累积减少,可恢复Ogura CMS育性[22]。

orf138分布在40%以上的日本野生萝卜中[23]。野生萝卜和栽培种orf138的序列分析显示,该基因编码区存在6个SNP和1个InDel。利用7种核苷酸变异的组合模式,orf138被分为9种单倍型(A—I型)。根据不同orf138单倍型以及抑制orf138表达的核育性恢复基因(Rf基因)在野生和栽培萝卜中的分布,发现orf138单倍型衍生自B型或C型,起源于日本野生萝卜[24]。H型是中国台湾省萝卜品种所特有的。最近发现日本萝卜品种表现出的雄性不育大多数为A型orf138,少数品种为H型orf138[25],说明H型orf138CMS已用于中国台湾省和日本培育的F1品种[26],因此对生长在中国台湾省和亚洲大陆的东亚野生萝卜胞质进行鉴定是确定Ogura CMS类型起源的必要条件。从目前已发现的不育材料来看,能明确导致雄性不育的有A、B、D、F、H型,其他类型还有待进一步验证。此外,B型orf138也在欧洲野生种自然种群中被发现,但并没有诱发雄性不育[27],表明至少有1个B型的Rf基因存在于欧洲自然种群中。

1.2 Kos CMS

Kos CMS是在日本萝卜‘Kosena’品种中发现的新型胞质,不育花朵完全无花粉囊,不能散粉。通过鉴定‘Kosena’orf138序列,发现有39个核苷酸缺失,并将‘Kosena’开放阅读框确定为orf125,编码17×103的蛋白;与orf138相比,编码区第95和99位核苷酸发生替换并存在39 bp缺失[28]。

1.3 NWB CMS

NWB CMS是在韩国萝卜资源中发现的另一种新的胞质不育类型[29]。与Ogura型不同,NWB型不育系能产生更多的淡黄色花药和一些不能存活的花粉粒;败育发生在单核小孢子时期,表现为绒毡层轻度液泡化,药室内仍有未染色的花粉粒空壳[30]。使用orf138基因特异引物在NWB CMS中未能成功扩增,表明NWB CMS并不是由orf138导致的。通过对32个线粒体基因RFLP分析发现,利用atp6基因3′区和nad3基因5′区可产生2 kb特异DNA片段,并开发了用于检测NWB CMS的特异分子标记[29]。NWB CMS系与58个育种系(主要为东亚长萝卜种质)杂交并没有发现任何恢复系,而与欧洲小萝卜的16个自交系杂交后,鉴定出3个恢复系[12]。通常在起源中心存在不育系及其恢复系,而保持系始终存在于远离起源中心的种群中[31],故推测NWB CMS系可能起源于欧洲野生萝卜。对可育和不育萝卜线粒体基因组测序,发现NWB CMS可能是由orf463a导致的[12]。尽管在罗马尼亚野生种R.raphanistrum和德国野生种R.maritimus中都检测到orf463a,但序列分析表明orf463a可能起源于R.raphanistrum[12]。

1.4 DCGMS CMS

DCGMS(Dongbu cytoplasmic and genic male sterility)是从乌兹别克斯坦收集的材料中发现的一种不同于上述3种类型的萝卜不育胞质,花药内有少量聚集花粉粒[32]。荧光素二乙酸酯(FDA)染色和扫描电镜显示,DCGMS CMS萝卜花粉粒变形严重,不能存活;细胞学观察表明其败育发生在单核小孢子时期,药室内部有未被染色的花粉粒。对可育、Ogura和DCGMS胞质3个完整线粒体基因组序列进行比较,在DCGMS mtDNA中发现1个1 551 bp独特区域,并在该区域鉴定出1个新嵌合基因orf463,由cox1基因128 bp部分序列和1 261 bp未知序列组成[11]。orf463分布在‘Niger’类群黑萝卜品种和野生萝卜中。尽管‘Niger’类群orf463的DNA序列与DCGMS相同,但野生萝卜中orf463序列包含9个核苷酸替换,其中7个是非同义的。多重PCR分析表明,所有含orf463的萝卜都具有DCGMS型和黑萝卜型线粒体结构[33]。调查orf463在野生种中的分布将有助于进一步了解其起源。此外,DCGMS型主要存在于从东欧引进的种质中[34]。大多数韩国培育的品系被鉴定为DCGMS保持系,欧洲萝卜种质可能存在多个Rf基因[35]。NWB和DCGMS CMS似乎具有相同起源,尽管其不育基因orf463和orf463a序列几乎相同,但它们线粒体基因组排列方式不同,表明这2种胞质可能属于同分异构型[12]。

2 萝卜CMS不育系细胞学特征

萝卜CMS不育主要表现为花粉败育。通过花药发育过程细胞学特征观察可确定花粉败育的时期和方式,并阐明败育与绒毡层之间的关系,为不育胞质分类提供了依据,也有助于揭示CMS机制。

2.1 不育系败育时期

被子植物雄性不育系花粉败育发生时期多种多样,双子叶植物花粉败育多发生在四分体时期或小孢子早期发育阶段,单子叶植物花粉败育则大部分发生在达到或接近双核期[36-39]。Ogura CMS花药败育多发生在四分体至单核花粉期[19,40-41]。属于Ogura胞质的雄性不育系40MA小孢子败育始于四分体阶段[42]。NWB CMS败育发生在单核小孢子时期[30]。不同类型萝卜保持材料转育的NWB CMS不育系A2—A4花粉败育均从单核小孢子时期开始,只是花粉粒降解程度有差异[43]。DCGMS CMS型花药特征与NWB CMS相似,其败育同样发生在单核小孢子时期,药室内有未被染色的花粉粒[32]。此外,发现不育系475A受阻于孢原细胞分化期之前[44]。‘灯笼红’不育系在造孢细胞时期就出现败育迹象[45],而不育系A1在减数分裂期发生异常[46]。

2.2 不育系败育方式

花粉败育主要受绒毡层与雄蕊微管系统发育异常、胼胝质溶解等影响[36]。萝卜CMS不育系花粉败育的主要原因是花药绒毡层发育异常。绒毡层细胞是花粉外壁的前体,能够为小孢子发育提供营养。此外,绒毡层可以通过分泌胼胝质酶使处于单核小孢子时期或四分体时期并被胼胝质包裹的小孢子释放出来[47]。胼胝质酶分泌时间对花粉正常发育至关重要,胼胝质壁溶解过早会导致发育中小孢子败育,不能释放花粉粒。细胞学观察发现绒毡层细胞液泡化并出现径向伸长、细胞边缘逐渐模糊、胞质染色较浅、细胞界限消失等现象;随后绒毡层细胞破裂形成细胞团块,侵入药室挤压小孢子,胞质进一步收缩并开始降解,最后药室形成空腔或仅剩少量残留物。由于绒毡层发育异常,物质转运功能受到阻碍,花粉发育所必需的可溶性糖、酶、蛋白质、核酸等缺乏,从而导致花粉败育。萝卜雄性不育株花器外观形态上存在花粉败育型和雄蕊萎缩型不育花,大部分属于花粉败育型[45]。不同雄性不育材料败育方式不同[37-38,41-46,48-53](表1)。

表1 萝卜雄性不育系败育的细胞学特征Table 1 Cytological characterization of pollen abortion in different radish cytoplasmic male sterility(CMS)lines

3 萝卜雄性不育性形成分子机制

3.1 不育基因的产生

线粒体DNA(mtDNA)序列通过频繁插入、丢失与重排会引起线粒体基因组的基因结构和组织形式发生改变,线粒体基因组中的短重复序列也参与mtDNA重排,产生新的嵌合基因[18,32,54]。萝卜Ogura CMS植株线粒体基因组全序列分析表明,与正常可育萝卜相比,该基因组发生了高度重排,其中1对大重复和多对短重复序列导致了基因组重组,并产生了4个Ogura型线粒体基因组特有区域,且这些独特区域大部分由芸薹属线粒体基因组同源序列组成。由此可见,在芸薹属植物进化过程中,这些独特区域是通过整合和重组已有的线粒体序列而产生的,重组过程中产生了orf138等新基因[10]。orf138位于atp8的5′区域,与atp8一起表达为双顺反子转录物[20,55]。

与DCGMS胞质相关的主要mtDNA结构是atp6-nad3-rps12,由短重复序列介导的重组事件引起。参与atp6基因周围mtDNA重排的短重复序列簇也作为重复序列存在于油菜、拟南芥的完整线粒体基因组中[56]。

与可育胞质相比,短重复(<1 kb)介导的同源重组导致NWB线粒体基因组序列共线性片段位置和方向发生了显著重排[12]。因此,由mtDNA重排所形成的嵌合基因是萝卜CMS产生的主要原因,这些重排大多发生在ATP1(ATPase 1)、ATP6(ATPase 6)、COX1(cytochrome C oxidase subunit 1)和ATP8(ATPase 8)等区域[55,57-60]。

3.2 不育基因作用机制

胞质雄性不育基因具有相似结构,能够编码特异蛋白,通常靠近线粒体功能基因并与其共转录,进而影响线粒体电子传递链的正常功能。mtDNA重排可以改变参与呼吸和ATP合成相关基因表达,干扰线粒体中ATP合成及其生理过程[61]。植物胞质雄性不育机制通常归纳为4种模型:能量缺乏模型、毒蛋白模型、异常程序性细胞死亡(PCD)模型和逆行调节模型[3]。由于胞质雄性不育机制较为复杂,能量缺失以及PCD两种模型存在交叉点,例如水稻H-CMS和辣椒Peterson CMS的不育基因,导致ATP能量合成下降,活性氧升高[62-64]。

Ogura CMS由线粒体orf138基因控制,该基因由2个共转录的开放阅读框orf138和orfB(atp8)组成[20]。ORF138蛋白存在于线粒体内膜中,易形成寡聚体,其表达能够抑制大肠杆菌的生长,因此ORF138可能对花药绒毡层中的线粒体活性产生一定程度的毒性[55,65]。Duroc[65]对ORF138进行截短分析,发现ORFΔ1-43(亲水部分,缺少前43个氨基酸)对大肠杆菌没有毒性,而ORFΔ58-138(疏水部分,包含第一个57个氨基酸)抑制了大肠杆菌的生长,结果表明不育基因的毒性与亲水和疏水域有关。最近研究发现,截去C端部分序列但保留跨膜螺旋的ORF1-93(缺少后45个氨基酸)能明显抑制大肠杆菌生长,而不含跨膜螺旋的ORF45-138(缺少前93个氨基酸)不能抑制大肠杆菌生长,进一步表明ORF138的毒性区域位于包含跨膜螺旋的N端[66]。辣椒Peterson CMS的不育基因orf456和orf507与cox2共转录,而orf507会损害CMS线粒体中的细胞色素c氧化酶活性,ATP酶活性降低,使小孢子发育ATP供应不足,最终导致花粉败育[64]。COX11是细胞色素c氧化酶的核编码组装因子,与呼吸链的能量代谢有关,还能清除细胞内活性氧。通过酵母双杂交(Y2H)试验筛选了水稻WA CMS不育基因所编码蛋白WA352相互作用蛋白,证实COX11与WA352互作。WA352蛋白在花粉母细胞期(MMC)绒毡层特异积累后与COX11互作,抑制了COX11清除活性氧的功能,使绒毡层活性氧爆发,从而诱导线粒体驱动的过早绒毡层PCD,导致花粉败育[67]。水稻HL-CMS的不育基因orfH79可以与线粒体复合物Ⅲ的亚基P61相互作用并降低其酶活性,导致线粒体中ATP下降从而引起败育。这些不育基因编码的跨膜细胞毒性蛋白可以与线粒体蛋白复合物相互作用,通过损害花药组织中的氧呼吸和ATP产生从而导致线粒体功能障碍[68]。atp8编码一个用于组装F1F0-ATP酶的核心亚基[69]。在萝卜中,orf138和orf125都与atp8共转录,因此可能具有类似机制,即orf138会与同源线粒体蛋白复合物(如atp8)相互作用,使线粒体复合物中酶活性降低,导致ATP降低,活性氧增加。这种缺陷导致线粒体中的能量产生功能障碍和氧化应激,这可能作为导致花粉发育异常的逆行信号,从而导致败育(图1)[3,70]。‘SW18’是由油菜‘Westar’和Kosena CMS萝卜之间的不对称细胞融合产生的新品种。Kazama等[71]利用转录激活物样效应器核酸酶(TALENs)和线粒体定位信号(mito-TALENs)敲除了Kosena型油菜品种‘SW18’的CMS相关基因orf125,结果恢复了CMS育性,这有力地证明了orf125是Kosena型油菜败育的原因。采用RACE-PCR检测DCGMS不育基因orf463的表达及转录起始,发现没有已知基因与orf463共转录,推测orf463拥有独立启动子,转录起始于起始密码子上游 219 bp 处[11]。与其他大多数CMS相关基因一样,orf463的预测编码蛋白产物包含12个跨膜结构域,该蛋白产物可能整合到线粒体膜中,进而导致雄性不育。近期发现orf463a编码具有跨膜结构域的蛋白,并与已知的线粒体基因coxI形成嵌合结构,从而导致萝卜NWB胞质雄性不育[12]。

图1 萝卜细胞质雄性不育的分子机制(改编自文献[3])Fig.1 Mechanism of cytoplasmic male sterility in radish(modified from reference[3])

4 萝卜CMS育性恢复基因的分子鉴定

来自CMS不育系的育性恢复基因(Rf)通常是核基因,编码线粒体定位蛋白,这些蛋白通过抑制CMS缺陷发挥逆行调节作用,使得育性恢复。目前已对几种CMS/Rf系统进行了深入研究。玉米Rf2基因是首个克隆的恢复基因,编码乙醛脱氢酶[72-73],但Rf2基因对玉米CMS相关线粒体基因urf13的表达没有明显影响。矮牵牛中分离克隆的Rf基因是第一个影响CMS相关线粒体基因表达的单显性基因[74],编码蛋白含有14个五肽重复(pentatricopeptide repeat,PPR)序列结构域,能大幅降低CMS相关蛋白丰度。

大多数CMS恢复基因可能通过阻遏线粒体CMS不育基因转录物表达,或降低其蛋白丰度来发挥育性恢复功能[75]。迄今多数已确定的Rf基因编码蛋白均含有PPR结构域[76-77]。PPR基因是高等植物中最大的基因家族之一,多数PPR蛋白靶向质体或线粒体[78]。PPR蛋白在细胞核中完成转录、翻译,通过蛋白上的定位信号可以精确进入目标细胞器中,参与细胞器中RNA代谢活动[79]。PPR蛋白参与RNA代谢主要有2种方式,一种是PPR蛋白直接参与RNA代谢、翻译和编辑[80-81],在转录水平上通过阻断不育相关的转录本或在转录后通过RNA编辑[82]、mRNA剪接[83]、蛋白质降解[84]来抑制不育基因的表达;另一种是PPR蛋白虽无法直接参与特定RNA序列调控,但可通过一些辅助因子组成蛋白复合体来行使对RNA的功能,如甘蓝型油菜pol CMS中MORF1蛋白与恢复基因Rfp编码的PPR蛋白形成蛋白复合体来编辑不育基因orf224转录本[85]。

4.1 Ogura CMS育性恢复基因Rfo

萝卜胞质雄性不育属于核质互作类型,经典性状遗传分析是基于配子活力相等,由于雌、雄配子活力基因型差异往往会影响某些性状遗传分析的准确性。前期研究认为萝卜CMS育性恢复至少由2对独立的显性基因控制[86-88]。进一步研究发现,Ogura CMS育性由线粒体嵌合基因orf138和核育性恢复基因Rfo共同调控(表2)[20,89-92]。Rfo基因可恢复不育株育性,在欧洲萝卜[93]、日本萝卜[25,94]及中国萝卜[87,90-91]品种中均发现Rfo基因。根据萝卜与拟南芥基因组微同线性,对萝卜Ogura CMS的Rfo基因进行图位克隆,通过遗传标记和物理作图将Rfo定位于15 kb的DNA片段[95];Rfo基因包含3个串联基因:PPR-A、PPR-B和PPR-C,其中只有PPR-B具有育性恢复活性,即为恢复基因。PPR-B编码P型PPR蛋白ORF687,含有17个重复PPR基序[96]。在体内ORF687直接或间接作用于orf138mRNA,调控ORF138 mRNA转录,阻止orf138翻译,使ORF138蛋白累积减少而恢复育性[22],但其确切结合位点尚不清楚。最近研究发现,PPR-B蛋白特异结合不育基因orf138mRNA,充当核糖体阻断剂以特异性阻止orf138mRNA翻译延伸,降低ORF138蛋白含量,从而达到育性恢复目的[97]。ORF687可直接结合orf138mRNA 中17核苷酸长的靶序列(GUAAAGUUAGUGUAAUA),来阻断A型orf138mRNA的翻译。由于A和H型在第61位SNP(A→C),降低了H型与ORF687结合亲和力,使ORF687对H型orf138的抑制无效[25],因此,ORF687可使A型orf138恢复育性,而对H型不起作用。

表2 萝卜中已鉴定的不育基因与恢复基因Table 2 The identified male sterile genes and fertility restoring genes in radish

此外,在中国萝卜品种‘2006H’和‘9802H’中发现2个与Rfo同源的恢复基因Rfob和Rfoc,在恢保关系上与Rfo存在差别[90-91]。Rfob基因与Rfo相比存在2个SNP,2个基因的距离为1.6 cM,而Rfoc是由Rfob的5′区和PPR24的3′区之间重组形成的嵌合恢复基因。Rft基因是在日本野生萝卜Tomioka群体中发现的1个新恢复基因,Rft基因与Rfo相比存在19个SNP[98]。Rft基因参与orf138RNA加工,使其编码区的5′端部分缺失,在RNA水平上抑制了orf138基因的表达。除了上述Rfob、Rfoc和Rft位点以外,在Rfo位点上还存在很多等位变异,如rfo152/rfo81[34]、L7rfo/D81Rfo[99]、PPR-B-31[100]等。

4.2 Ogura CMS育性恢复基因Rf3

Rf3是在萝卜中发现的与Rfo紧密连锁的新恢复基因(表2)[37]。图位克隆发现RsRf3定位于1个4 kb区域,编码479个氨基酸的PPR蛋白,包括35个氨基酸PPR基序的11个拷贝。RsRf3与Rfo蛋白有85%相似性。编码PPR蛋白的杂合等位基因(RsRf3-1/RsRf3-2)能够恢复CMS育性。在此基础上又发现了新的相关等位基因RsRf3-4[101]、RsRf3-5[102]。

4.3 Ogura CMS育性恢复基因Rfs

orf138根据编码区序列差异被分为9种单倍型(A—I型)。日本CMS品种‘BK’与可育品种‘SK’均为H型orf138、RfoRfo基因型且不含Rft。将‘BK’בSK’(杂交)后代与‘MR’(H型orf138,rforfo)进行杂交,发现后代出现了育性分离,同时在后代所有可育单株中均鉴定出完整orf138mRNA结合位点;但‘BK’בSK’后代与‘MS-G’(A型orf138,rforfo)进行杂交的后代均表现为不育,这表明除Rfo和Rft之外的另一种Rf基因(Rfs)能够恢复花粉育性(表2)。与Rfo不同的是,Rfs可在编码序列开始的第156～159个核苷酸附近结合H型orf138mRNA,但不能结合A型orf138mRNA。因此,需要对Rfs进一步鉴定并确定其氨基酸序列,以便在分子水平上揭示Rfs与orf138类型相关性[25]。

4.4 Kosena CMS育性恢复基因Rfk1

从萝卜中分离出Kosena CMS育性的恢复基因,命名为Rfk1(表2)[92]。利用F2群体对Rfk1位点进行AFLP标记作图,其中2个AFLP-STS标记与Rfk1距离分别为0.1 cM和0.2 cM,最终确定Rfk1是包含 43 kb 的DNA片段,该基因也编码687个氨基酸。虽然控制Ogura CMS和Kosena CMS的不育基因不同,但都是ORF687蛋白在不改变mRNA水平情况下,直接或间接降低了CMS相关线粒体基因蛋白(ORF138、ORF125)水平使其育性恢复。因此,从遗传学角度看,Kosena CMS-Rf体系与Ogura CMS-Rf体系是相同的[88]。应用基因组原位杂交(GISH)和细菌人工染色体-荧光原位杂交(BAC-FISH)方法对Rfk1基因的萝卜染色体区域进行物理定位,最终将Rfk1基因定位于油菜A基因组中9号染色体上[103]。

4.5 DCGMS CMS育性恢复基因Rfd1

Kim等[35]在不育材料‘MS19’和可育材料‘R121’的杂交群体中,发现1个单个育性恢复位点Rfd1,能够恢复DCGMS CMS育性(表2)。利用RAPD和AFLP技术对F2群体分离分析,在Rfd1等位基因连锁侧翼序列间分别鉴定出773和67 bp的InDels,并以此开发了PCR标记。此外,遗传关系分析表明Rfd1位点独立于Rfo位点。基于萝卜与拟南芥基因组的共线性,开发了Rfd1基因的分子标记,并构建了该基因的高分辨率连锁图谱,将Rfd1位点定位在拟南芥3号染色体上220 kb区间内[104]。利用BSA和RNA-Seq技术构建了高密度SNP连锁图谱,将Rfd1精细定位于拟南芥3号染色体上83 kb的共线性区域,该区域含有25个基因,但均不包含PPR基序,表明Rfd1基因可能不编码PPR[105]。进一步发现育性恢复基因不影响orf463mRNA加工,推测是在orf463翻译过程中发挥作用[33]。

5 萝卜雄性不育性的利用

萝卜是典型的异花授粉作物,雄蕊和雌蕊较小,人工去雄费时费力。利用雄性不育系制种不仅能充分利用杂种优势,而且F1杂交种种子纯度高、一致性好[106]。利用雄性不育系进行优良一代杂交种品种选育是萝卜杂种优势高效利用的主要途径。

5.1 CMS育性恢复基因标记开发与利用

常规育种中选育恢复系的主要方法是通过杂交和测交来鉴定恢复基因,但这种方法年限长,工作量大。分子标记辅助选择育种可以在早期对恢复基因进行鉴定,大大缩短育种周期,加速恢复材料的选育过程、提高育种效率。恢复基因的标记开发能够为种质创制打下基础。恢复基因Rfo在日本野生萝卜中的分布频率较低。我们根据Rs-Rf1和Rs-rf1等位基因间序列差异分析,发现限制性内切酶SspⅠ的识别位点数量不同,并开发了功能标记以快速区分个体Rs-Rf基因型[107]。利用该功能标记建立了分子标记辅助培育萝卜优良CMS系的技术体系,促进候选保持系的鉴定,加速了优良CMS品系和F1杂交种的培育进程。

基于KASP基因分型技术开发萝卜Ogura CMS恢复基因Rfo的SNP标记,能够研究不同萝卜种质资源中恢复基因分布,并应用于保持系材料筛选[108];目前利用该方法转育了6套遗传稳定的萝卜CMS系及其相应保持系。在此基础上,利用多个生态型萝卜品种进一步研究Rfo分布,为雄性不育系的转育提供指导[109];通过KASP基因分型技术在苗期即可快速鉴定植株育性,缩短了育种周期。选择隐性纯合基因型的单株进行杂交、多代回交,即可获得不育率100%和遗传稳定的雄性不育系及保持系,以便用于优势杂交组合配制[110]。因此,恢复基因鉴定及标记开发对雄性不育系高效选育具有重要的指导意义。

5.2 萝卜雄性不育系转育和利用

龚义勤等[111]通过引进不育源或应用鉴定发现的不育株,采用测交、父本株自交和连续回交的方法,进行CMS不育系转育和保持系筛选,进而利用不育系配制了一代杂种。韩太利等[112]以韩国白萝卜改良型雄性不育系为材料,转育出耐抽薹型白萝卜不育系VMS01-96-07、VMS03-1-36和早熟型白萝卜不育系VMS01-98-16及相应保持系;配制的杂交组合生长势和抗病性提高,表现出显著的杂种优势。史小强等[113]以雄性不育系金花薹48A为不育源,选用8个不同遗传背景的秋冬青萝卜自交系为转育父本,选育出不育率和不育度均为100%的优良萝卜雄性不育系06-42A及相应保持系,同时所配组合表现出较强的杂种优势。胡天华等[114-115]分别以秋冬萝卜雄性不育系浙3A和NS04A为不育源,选育出耐抽薹萝卜不育系CL09A和心里美萝卜不育系XM221-131A,这2个不育系经济性状好,不育株率达100%,不育性稳定,开花结实性状优良;利用其配制的组合具有生食口感风味好、根形优、商品性好等特点,杂种优势较强。本课题组通过恢复基因标记辅助转育与常规转育相结合,培育出一批遗传稳定、综合性状优良的萝卜CMS不育系,并广泛应用于特色萝卜一代杂交品种的培育,例如‘南春白5号’‘南春白8号’‘南春白9号’‘南热红3号’等特色品种。

5.3 作为萝卜近缘种的不育胞质源

白菜、甘蓝、油菜等芸薹属作物在很长一段时间内没有理想的不育源,通过属间杂交、体细胞杂交、重复回交和原生质体融合等手段,将萝卜Ogura不育胞质成功转到芸薹属作物的核背景中,并广泛应用于芸薹属作物F1杂交种的培育[116-118]。转育得到的萝卜Ogura不育胞质的芸薹属作物雄性不育系,往往存在苗期低温黄化、雌蕊功能障碍、雄蕊瓣状、花药开裂、蜜腺发育异常和结实不良等缺陷[119]。推测可能是由于芸薹属细胞核和萝卜细胞质基因组之间的不相容性引起的[120-121]。因此,开发低温下不黄化、雌性活力正常、种子生产能力强的改良型Ogura CMS不育系,对于基于Ogura CMS的芸薹属作物F1杂种优势利用至关重要。至今已利用Ogura不育胞质源选育出了‘中甘628’‘中甘56’‘京甘4号’‘西苑秋丰’‘苏甘27’‘春秋亭美’等优良甘蓝品种[122]:‘秦白4号’‘晋绿3号’‘晋青2号’‘青丰1号’等白菜品种[123-125]以及Ogura CMS青花菜主栽品种‘18-耐寒优秀’和‘18-炎秀’[126]。Ren等[127]利用远缘杂交及标记追踪技术,首次创制了甘蓝Ogura育性恢复材料16Q2-11;利用该恢复材料成功恢复了抗根肿病种质资源的育性,获得了聚合育性恢复基因Rfo和根肿病抗性基因CRb2的育种材料。以甘蓝自交系为母本,恢复育性的抗根肿病材料F8-514和F8-839为父本,成功将不育胞质替换为可育胞质,将根肿病抗性基因CRb2转移到正常胞质甘蓝自交系中,获得重要抗根肿病育种材料。“两步法(育性恢复和胞质替换)”的成功实践,改变了甘蓝Ogura不育资源无法利用的现状,进一步丰富了甘蓝种质资源的多样性,对十字花科蔬菜作物的Ogura不育资源的创新和再利用提供了重要借鉴和参考。

6 问题与展望

CMS对于阐明核-质互作机制具有显著的理论价值,一直是植物科学研究的重要领域。萝卜作为典型的异花授粉植物,杂种优势显著,CMS利用早已成为萝卜杂种优势利用的重要途径。特别是萝卜Ogura不育胞质成功转到油菜、甘蓝、白菜等近缘芸薹属作物中,有力推动了芸薹属作物杂种优势利用,同时也显著促进了萝卜CMS机制的解析。

萝卜Ogura CMS研究始于1968年,研究表明,萝卜CMS缘于mtDNA发生重组,从而产生新的嵌合基因,嵌合基因编码的细胞毒性蛋白会引起败育。但是,关于不育蛋白毒性的证据仅来自原核或真核培养细胞系统中不育基因的表达[128],仍缺乏不育蛋白毒性与植物花药败育相关的直接证据,导致CMS的有毒蛋白质的结构与CMS发生之间的机制关系仍不清楚。对辣椒Peterson CMS、水稻WA CMS和HL CMS的不育基因与线粒体复合物研究后发现[64,67-68],不育蛋白可能会影响线粒体膜的完整性,导致质子泄漏和ATP不足,从而引起败育。因此,还需进一步研究orf138与线粒体复合物(如atp8)之间的关系来解释萝卜败育机制。另外,单一胞质不育源应用有可能导致某一病害大面积暴发,故发现和利用更多新型不育源也是萝卜CMS研究亟待解决的问题。

许多与CMS相关的不育基因和一些相应的恢复基因已被鉴定,在解析线粒体基因组重排产生不育基因、花药绒毡层凋亡、线粒体功能障碍、线粒体ATP合成酶活性及ATP含量降低等与CMS表型相关的机制方面已取得一定进展。然而,对于大多数CMS系统,不育蛋白的积累和诱导CMS的机制仍不清楚,不育蛋白和恢复基因蛋白的互作以及线粒体逆行信号尚未确定;而且一些相关育性恢复机制的阐明是在萝卜不育胞质转到近缘芸薹属作物中进行的,在萝卜中胞质不育基因与Rf基因的互作还有待进一步深入解析。

不同萝卜CMS胞质的恢复基因已被鉴定,目前研究最多的是Ogura CMS的Rfo。通过分析不育基因及恢复基因遗传模式、结构特征和作用机制,初步阐明了萝卜Ogura CMS形成与育性恢复机制,即恢复基因所编码的PPR-B蛋白特异结合不育基因orf138的mRNA,充当核糖体阻断剂,特异性地阻止翻译延伸,降低ORF138蛋白含量,从而恢复育性;但恢复基因所编码PPR-B蛋白上的结合位点尚需鉴定。随着用于程序化RNA识别的人工PPR设计的成功[129-130],现在可以考虑针对CMS相关orf的mRNA或蛋白质进行Rf设计,以研究Rf与orf基因之间的关系。在水稻中发现定位于细胞质的恢复基因所编码的CPPR1蛋白通过下调OsGLK1(OsGOLDEN-LIKE1)转录水平来调控绒毡层质体发育,从而确立了一种新的水稻花粉发育调控机制,为研究败育机制提供了新途径[131]。CMS中的自发育性恢复已在玉米S-CMS、胡萝卜、大豆和芸薹属作物中观察到,并且在自然界中作为克服线粒体编码的雄性不育替代方法[132-133]。CMS中自发育性恢复通常以线粒体基因组亚化学计量迁移(substoichiometric shifting,SSS)为特征,小重复不对称DNA交换会影响线粒体基因组SSS[134]。这种重排受核基因影响,包括抑制异位线粒体重排的OSBI(organelle ssDNA binding protein)、RecA3(recombinase A3)和MSH1(MutS HOMOLOG1)。MSH1的破坏不仅会导致线粒体SSS,还会导致烟草、番茄和芥菜出现雄性不育[135-137]。研究发现,MSH通过与芥菜不育基因orf220的SSS来介导育性恢复,这一过程会受到授粉信号调节[137]。目前还有很多恢复基因尚未分离鉴定,影响了恢复基因相关育性恢复机制的解析以及相应CMS不育系的高效应用。

新技术进步有助于解决当前研究CMS/Rf系统所面临的问题。随着高通量测序技术快速发展,通过高通量测序确定CMS不育系完整线粒体基因组序列也为寻找新的CMS候选orf提供了一种有效方法。目前,不同萝卜胞质类型的线粒体基因组已经测序,通过线粒体基因组对比,可以开发不同胞质类型特异的线粒体DNA分子标记。这些特异的标记可以用于指导萝卜胞质分类及鉴定、区分新型胞质类型、选育保持系以及恢复系、鉴定不育系纯度、提高育种效率等。基因编辑技术为验证CMS相关不育的功能和在基因组水平恢复CMS提供了新策略。最近报道一种用于植物线粒体基因编辑特别设计的质粒,利用CRISPR/Cas9技术可以实现线粒体基因编辑[138];也有学者通过mito-TALEN介导线粒体基因组编辑技术敲除了BT型CMS水稻orf79和Kosena型CMS油菜orf125,从而使其育性恢复[71]。利用基因编辑技术对CMS不育基因与恢复基因进行碱基突变与生物学功能分析,将有助于全面阐明CMS发生的分子机制,从而为萝卜CMS不育性的高效利用提供重要的理论支撑。