不结球白菜遗传育种与分子生物学研究进展

侯喜林,李英,刘同坤

(1.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺作物种质创新与利用教育部工程研究中心,江苏 南京 210095;2.南京苏曼等离子工程研究院,江苏 南京 210095)

不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)是十字花科(Cruciferae)芸薹属芸薹种的3个亚种之一,为一、二年生草本植物。因其种质资源丰富、生长周期短、单位面积产量高、易栽培等特点,在我国中部及以南地区周年栽培种植,占据市场经济重要份额。此外,不结球白菜中富含矿物质、膳食纤维、维生素,对调节人体酸碱平衡、新陈代谢及预防疾病具有重要作用[1]。

21世纪以来,生物技术在不结球白菜育种上得到广泛应用,我国各育种单位培育出一大批不结球白菜新品种,如南京农业大学的‘黄玫瑰’‘南农矮脚黄’,安徽农业大学的‘徽乌’系列,上海市农业科学院的‘上海青’等,我国不结球白菜的育种居世界领先水平。现将近年来不结球白菜的遗传育种与分子生物学研究进展综述如下。

1 不结球白菜的6个变种

在原有工作基础上[2],根据基因组学研究结果,将不结球白菜确定为以下6个变种(图1):普通白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino var.communisTsen et Lee,别名:白菜、小白菜、青菜、油菜等)、乌塌菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino var.rosularisTsen et Lee,别名:塌菜、塌棵菜、塌地菘、黑菜等)、菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee,别名:绿菜薹、菜尖等)、菜心(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino var.parachinensis;别名:广东菜、菜花等)、薹菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino var.tai-tsaiHort)、分蘖白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino var.multicepsHort,又称多头菜)。2021年不结球白菜在全国的栽培面积已达到133.33万hm2,比2005年提高了2.5倍。

图1 不结球白菜的6个变种Fig.1 Six variations of non-heading Chinese cabbage

2 不结球白菜优异种质资源

2.1 优质种质资源

不结球白菜优异种质资源不仅具有较高的营养品质,同时具有良好的产品商品性,其主要的营养品质性状包括维生素C、可溶性糖、可溶性蛋白质、粗纤维、有机酸、花青素含量等。不结球白菜中维生素C含量的遗传符合主基因和多基因的混合遗传模型[3]。目前有多个维生素C合成途径相关酶基因的功能被报道可以提高植株体内维生素C的含量,如BcMDHAR(monodehydroascorbate reductase)、BcPMI2(phosphomannose isomerase 2)、BcGLDH(glycerol dehydrogenase)[4-6]。南京农业大学利用分子标记辅助选择技术选育出稳定的自交不亲和系,并用其配制杂种一代,选育出高维生素C含量的不结球白菜新品种。由花青素积累导致的紫叶是不结球白菜的一个重要性状,花青苷具有抗氧化、降血脂和血糖以及抗癌等功效[7]。不结球白菜中也有富含花青苷的品种,如紫色乌塌菜、紫菜薹等。研究发现绿叶类蔬菜中硝酸盐含量较高,降低蔬菜中的硝酸盐含量对提高蔬菜品质具有重要的意义[8]。汪李平等[9]对不结球白菜46个品种进行四季栽培,并对硝酸盐含量进行比较与筛选,发现不结球白菜中硝酸盐含量通过基因型差异稳定遗传,同时受环境因素影响。硝酸盐含量较低的不结球白菜种质资源有‘上海青’‘热优2号’‘矮脚奶白菜’‘矮抗青’‘上海夏冬青’和‘勺白菜’。为提高不结球白菜商品性,曹寿椿等[10]选育出商品性好、品质优且适应性广的系列品种‘矮抗5号’和‘矮抗6号’。经过多代筛选,目前已拥有36份抗芜菁花叶病毒病、耐热、晚抽薹、耐寒的优质种质资源,如‘矮脚黄’‘苏州青’‘短白梗’‘南农矮脚黄’‘四倍体苏州青’等。

2.2 抗病种质资源

不结球白菜生长过程中主要受芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、霜霉病菌(Peronosporaprasitia)、黑斑病菌(Alternariabascae)的侵染以及软腐病、根肿病等病害影响,严重影响不结球白菜的产量和品质,因此提高抗病性一直是不结球白菜的重要育种目标。刘克均等[11]筛选了84份经芜菁花叶病毒、霜霉病菌、黑斑病菌单抗鉴定的自交系,并对其进行3种病害苗期人工诱发接种多抗性联合鉴定,成功获得了21份三抗材料。霜霉病是一种严重的不结球白菜真菌病害,Liu等[12]研究表明,BcPR-5L(pathogenesis-related 5-like)基因可能在不结球白菜抗寄生蜂感染中发挥重要作用。张慧[13]研究发现不结球白菜根肿病抗性可能受一对显性基因控制,且不结球白菜的根肿病抗性鉴定最宜选用菌土接种法。目前国家农作物种质资源库对现有不结球白菜种质资源进行了鉴定评价,其中对抗TuMV性状鉴定了 1 000份,鉴定出高抗和抗病的材料8份。此外,研究者们已克隆分析了很多不结球白菜抗病相关基因,如BcCPR1(cytochrome P450 reductases)[14]、BcSGT1(suppressor of the G2 allele of skp1)[15]、BcPR5(pathogenesis-related 5)[16]、BcOPR3(12-oxo-phytodienoic acid reductase)[17],为不结球白菜抗病分子机制研究奠定了基础。

2.3 抗逆种质资源

不结球白菜喜冷凉气候,在25 ℃以上的高温天气生长衰弱,易感病毒病,因此不结球白菜的耐热性研究是遗传育种的重要领域。余长春等[18]利用武汉夏季自然高温环境对78份不结球白菜自交不亲和系进行热害指数测定,发现四季矮脚特白梗奶白菜的热害指数在所有材料中最低,且具有更高的过氧化物酶(POD)、超氧化歧化酶(SOD)活性和更低的丙二醛含量及相对电导率,说明植株对高温具有较强的耐受力,与陈以博等[19]对不结球白菜幼苗耐热机制研究结果一致。此外,许多与不结球白菜耐热相关基因的陆续被发现,如BcPLDγ(phospholipase D γ)[20]、BcHSP70-1(heat shock protein 70-1)[21]、BcHSP(heat shock protein)[22]等。Yarra等[23]的研究表明,核仁DEAD-Box RNA解旋酶TOGR1提高了不结球白菜植株的耐热性。Xu等[24]对不结球白菜的参考基因组和全转录组的分析为芸苔属植物表皮蜡质形成和耐高温等重要性状的遗传改良提供了理论基础。目前已培育出多个耐热性强、生长势强、束腰性好、产量高的新品种,如‘热抗青’[25]、‘夏绿妃’[26]、‘青梗316’[27]、‘东方2号’[28]、‘苏夏2号’[29]、‘烤青’[30]、‘暑热’[31]、‘暑绿’[32]等。不结球白菜新品种‘寒笑’具有株型美观,营养成分含量高并适于在秋冬季和冬季栽培的优点,解决了不结球白菜冬春季不耐寒的问题。‘矮杂二号’和‘矮杂三号’均为耐寒品种,‘矮杂二号’和‘矮杂三号’在全国10余省的广泛推广为解决蔬菜“春缺”起到关键作用。随着分子生物学的进步,不结球白菜中的抗寒基因依次被报道,大力推进了不结球白菜的抗寒育种工作。研究发现BcFLC1(flowering locus C)诱导了CBF1,2,3(C-repeat/DRE binding factor)和COR15a(cold-regulated 15a)的表达,从而提高植物的抗寒性[33]。任海波等[34]从不结球白菜中克隆并获得了耐寒基因BcICE1(inducer of CBF expression 1),在拟南芥中过表达研究发现BcICE1基因能增强植株抗寒性。

2.4 特殊种质资源

2.4.1 雄性不育系种质资源Edwardson[35]将细胞质不育和核质互作不育统称为细胞质雄性不育(CMS)。任成伟等[36]首次获得了不结球白菜Pol细胞质雄性不育材料,并对其黄化缺陷进行了研究和改良。侯喜林等[37]首次获得不结球白菜原生质体非对称融合新胞质雄性不育系,克服了Ogura不育源苗期黄化、无蜜腺等缺陷。马志虎等[38]以不育株率达100%、不育度大于95%、性状稳定一致、苗期叶色表现黄色遗传标记的异源胞质雄性不育系‘黄苗寒青A-22’为母本,以不结球白菜‘BC071’为父本,选育出增产显著、长势强、抗病性强的耐热组合‘翠夏’。

2.4.2 自交不亲和系种质资源自交不亲和性是显花植物特有的一种自我识别能力,也是重要的防止近亲繁殖增加变异的遗传机制[39]。曹寿椿等[40]用花期自交和蕾期自交的方法,选育出了不结球白菜‘矮脚黄’自交不亲和株,并在其后代中用混合花粉授粉法选育自交不亲和系,参照系内亲和指数、单株亲和指数和蕾期自交、花期自交的结籽情况,对材料进行选择,育成自交亲和指数稳定在1.0以下的自交不亲和系。

2.4.3 多倍体种质资源陈丽[41]利用磺灵诱导成功获得营养品质更丰富的‘黄玫瑰’同源四倍体,与二倍体植株相比,四倍体植株的叶绿素、可溶性蛋白、可溶性糖含量都有大幅度提高,而纤维素和硝态氮含量显著降低。钟程等[42]通过秋水仙素诱导2n配子,再与四倍体雄性不育系‘08P76’杂交创制的四倍体不结球白菜雄性不育材料,为不结球白菜新品种的选育提供了具有生长速度快,丰产、抗病、抗热等特性的优良亲本。为更高效获得多倍体种质资源,目前多采用适宜浓度的秋水仙素滴定不结球白菜幼苗生长点的方式诱导产生具有优良性状的新种质资源,如‘五月慢’[43]、四倍体‘十月红菜薹’[44]、‘矮脚黄’[45]等。

2.4.4 耐抽薹种质资源耐抽薹是不结球白菜的重要性状,除制种需要外,抽薹越晚,蔬菜的商品性食用性越高。中国农业科学院蔬菜花卉研究所已从556份普通白菜种质资源中筛选出自播种至抽薹时间大于80 d的晚抽薹材料3份。曹寿椿等[46]在对各地迟熟品种的调查、引种和选择基础上,筛选出20个晚抽薹品种;通过品种比较发现‘上海五月慢’是一个优良的晚抽薹品种,比一般迟熟品种延迟10～15 d抽薹;同时,对各品种的抽薹期和抽薹速度,最适播种期和产量及品质进行了较全面的观察与分析,并依据现蕾与抽薹速度,将晚抽薹种质资源归纳为3种类型:慢薹型、速薹型、渐薹型,抽薹期愈晚则单位面积产量和每日生产率愈高。

3 不结球白菜育种技术的发展及应用

3.1 多倍体诱导技术

多倍体植物往往具有抗逆性强、丰产性高、营养器官大、营养物质含量高、无核不育等优良特征,利用这些优势,在生产中选育优质多倍体材料,能够取得巨大的社会效益和经济效益[47]。

目前市场上多为二倍体不结球白菜,为提高不结球白菜的产量、品质及抗病性,育种专家进行了一系列不结球白菜多倍体诱导方法的探究。户秋稳等[48]用秋水仙素诱导不结球白菜加倍,发现诱导出的四倍体植株表现出营养价值高、农艺性状好且晚抽薹的特性。潘静雯等[49]使用1、2和3 g·L-1的秋水仙素溶液点滴处理二倍体‘苏州青’幼苗植株的子叶生长点,诱导出营养品质更高的不结球白菜‘苏州青’四倍体。王雅美等[50]诱导获得的同源四倍体‘四月白’抗寒能力强,光合产物高,更能适应低温环境;王红尧等[51]通过诱导获得性状优良、营养品质高的同源四倍体不结球白菜‘五月慢’,为后期不结球白菜多倍体育种工作提供新的种质资源。宋莹等[52]使用2 g·L-1的秋水仙素溶液点滴处理二倍体‘黄心乌’幼苗的子叶生长点,获得了高产、抗病的同源四倍体不结球白菜‘黄心乌’新材料。彭丹[53]以二倍体不结球白菜‘夏帝’和‘烤青’为材料,采用秋水仙素诱导法获得四倍体,在夏季抗热性试验中四倍体‘烤青’和‘夏帝’表现出丰产性。

3.2 游离小孢子培养技术

与不结球白菜传统的育种方法相比,小孢子培养技术可以在更短的时间内筛选优质的抗病材料和突变体,大大减少了育种所需时间及成本。曹鸣庆等[54]和严准等[55]分别通过游离小孢子培养获得不结球白菜、甘蓝的单倍体植株。此后研究人员针对基因型、低温胁迫、热激处理以及培养基添加物等对小孢子出胚率的影响展开一系列研究。Kabir等[56]研究了乙烯拮抗剂氯化钴和硝酸银对不结球白菜小孢子胚胎发生的影响。Niu等[57]通过优化培养基添加物,创制了一套高效的菜心游离小孢子培养方案。黄天虹等[58]以20个不同基因型的不结球白菜为试验材料,研究不同基因型、4 ℃低温胁迫处理时间和头孢噻胯浓度对游离小孢子胚胎发生的影响,优化培养方案成功获得了不结球白菜小孢子再生植株,并通过倍性鉴定发现存在双单倍体。耿建峰[59]将不结球白菜‘暑绿’进行游离小孢子培养,并以获得的112个双单倍体(DH)株系为作图群体成功构建了第1张不结球白菜遗传连锁图谱。

3.3 分子标记技术

1995年,漆小泉等[60]以大白菜和紫菜薹自交系为材料,进行染色体组DNA的RAPD研究,探讨这一技术应用于蔬菜遗传多样性的可行性。不结球白菜‘马耳头’和‘苏州青’是2个表型差异比较大的品种,刘坤宇[61]利用这2个材料构建了含有65个SSR分子标记、总长971.05 cM的高度精确的遗传图谱。刘冬媛等[62]利用SSR分子标记对不结球白菜的遗传分化进行了分析,结果发现中国的种质资源要比日本、韩国等国家丰富,且以江淮流域的遗传多样性最高。随着不结球白菜全基因组测序的完成,将会有更多的SSR和SNP分子标记在染色体和相关基因上实现定位,为分子标记辅助育种奠定了基础[63]。班青宇[64]将不同品种的不结球白菜进行杂交得到F2群体,通过对抽薹性状的统计与分析,分别定位出4个与抽薹时间相关和5个与开花时间相关的QTL位点。冷月强[65]通过RAPD分子标记与BSA法联合分析,筛选出1个不结球白菜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记AY121238。

此外,全基因组选择作为一种新型辅助育种技术,通过对全基因组的大量分子标记进行测定,根据基因组的预估育种值对早期个体进行预测和选择,提高选择效率,加速育种进程[66]。目前,全基因选择育种主要应用于动物育种及农作物育种工作中,而在不结球白菜中鲜有报道,但随着全基因组选择的逐步应用,不结球白菜体系也将逐步建立与完善[67-69]。

3.4 基因编辑与转基因技术

李海艳[70]通过农杆菌介导法在大白菜中构建出高效稳定的遗传转化体系,并利用CRISPR/Cas9系统对大白菜基因组进行单靶点编辑,成功建立了大白菜基因编辑体系。侯忠乐[71]应用PEI-SWNT瞬时转化技术检测不结球白菜CRISPR/Cas9系统候选sgRNA的基因编辑效率,再应用花粉磁转化技术在白菜上实现基因编辑,并获得紫色不结球白菜的新种质。基因编辑技术作为基因组编辑的有力工具,能够通过基因突变改良作物性状,也可以通过外源基因的定点插入,实现对作物显性性状如植物抗病害能力等的改善。石育钦等[72]研究发现利用CRISPR/Cas9技术突变BnMLO6(mildew resistance locus O)基因能够提高甘蓝型油菜抗白粉病的能力,为油菜抗病性遗传改良提供了抗性资源和技术支撑。利用该技术进行改良的转基因后代不需要进行大规模的基因型与表型筛选,与常规育种相比,极大地节省时间和成本。

Kim等[73]通过对转基因不结球白菜‘CT001’重测序,分析了转基因植株T1和T3子代中的遗传变异,共筛选出12个与目的基因相关的SNP,并与普通植株进行对比分析,证明转基因植株中目的基因会受农杆菌介导的转化过程影响,为更好地了解转基因植株的遗传多样性提供了基础信息。王惠玉等[74]通过基因沉默的方法验证了不结球白菜中BcGI(Gigantea)基因与开花相关,这对今后利用转基因技术获得耐抽薹的不结球白菜品种具有重要意义。不结球白菜生产中的病虫害,尤其是虫害一直是困扰生产的一个难题,为减少农药的使用保证食品安全,进行转基因育种成为不结球白菜抗病虫种质创新的关注焦点。佘建明等[75]以普通不结球白菜品种‘中脚黑叶’和‘矮脚黑叶’种子无菌苗的子叶为外植体材料,用农杆菌介导法将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因导入普通不结球白菜栽培品种,成功获得抗虫转基因植株。杨学东等[76]以不结球白菜品种‘苏州青’为材料,验证了病毒载体pTY在白菜上诱导基因沉默的能力,建立的白菜病毒诱导基因沉默VIGS体系已成为不结球白菜抗病、生长发育及代谢调控研究方面的工具。

4 展望

不结球白菜已发展成为一种世界性的蔬菜作物。在不结球白菜的种质创新、细胞质雄性不育系的利用、分子标记技术、抗病及晚抽薹育种等方面都积累了重要成果,从2020年起,在基因组学和基因功能验证方面取得了重大突破[63,77-85],例如首次证实不结球白菜BcABF3(ABRE-binding factor 3)是除CDF(cycling Dof factor)、FBH(flowering BHLH)和TCP(teosinte branched 1/cycloidea/proliferating cell nuclear antigen factor)转录因子以外能直接与CO启动子结合并激活其表达的转录激活因子,并由此介导ABA(abscisic acid)诱导的成花转变[78];明确了抗病基因BcWRKY33(WRKY DNA-binding protein)增强不结球白菜耐盐性的分子机制[80]。

目前不结球白菜育种仍存在许多问题,如耐热种质资源缺乏,优质抗逆难聚合等,因此,不结球白菜育种在以下几方面有待加强。在种质资源方面,继续搜集不结球白菜原生境边缘种质资源,特别是加强野生、半野生种质资源的保护,扩大种质资源遗传多样性,创制更多育种材料。育种技术随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展也步入了新的阶段,在育种技术方面,继续进行不结球白菜生物育种技术研究,特别是加强基于基因组的分子设计育种技术研究。在分子生物学方面,急需建立高效的不结球白菜遗传转化体系,传统的不结球白菜育种包括杂交育种虽可选育出优良品种,但育种效率较低。为了改良现有品种品质,通过转基因技术及基因编辑技术从而有针对性地改良基因。这些新技术将促进不结球白菜育种发展,并产生新的高品质不结球白菜品种。