马铃薯块茎不同发育时期淀粉合成相关基因表达与淀粉颗粒大小分析*

刘婕， 艾菊， 高冬丽

(云南师范大学 云南省马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明 650500)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是一年生茄科茄属作物，是继水稻和小麦之后的第四大主粮作物，也是世界上最重要的块茎类粮食作物.马铃薯块茎富含淀粉，其含量达到薯块干物质的80%左右.叶片合成的蔗糖被运输到马铃薯块茎内，蔗糖透过块茎细胞的细胞壁进入细胞内，然后在蔗糖合酶(SuSy)等一系列酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸(G6P).G6P由葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运蛋白(GPT)转运进入质体，开始淀粉的合成[1].腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)焦磷酸化酶是淀粉合成的限速酶，ADPG作为淀粉合成前体通过可溶性淀粉合酶(SSs)、淀粉分支酶(SBE)、颗粒结合性淀粉合酶(GBSS)等酶的相互协同作用催化形成淀粉[2].Van Harsselaar等利用拟南芥的淀粉合成酶在马铃薯基因组中进行了同源基因搜索，系统鉴定了马铃薯淀粉代谢相关的基因[3]，但这些基因在块茎发育过程中的表达变化还没有详细的研究.

淀粉以颗粒的形式贮存于细胞中，淀粉颗粒的大小、性状和组成等因植物种类和器官而异.李芬芬等采用聚焦光束发射仪法，测得马铃薯淀粉的粒径大小为31.3 μm[4].詹锦玲等采用酶解动力学等方法，发现结构无破损的马铃薯淀粉颗粒的粒度大小与其酶解特性相关联，淀粉颗粒越小，其比表面积越大，酶解效率越高[5].以上研究针对的是成熟块茎的淀粉颗粒粒径，块茎在早期发育过程中淀粉颗粒大小如何变化尚未可知.此次研究利用块茎7个发育时期的样品，检测了8个淀粉合成相关基因的表达，分析了颗粒粒径的变化，以期为进一步解析淀粉合成代谢和淀粉颗粒大小的遗传机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 RT-qPCR

取二倍体马铃薯CIP149块茎发育早期的7个时期的块茎(最小直径约为0.3 cm，最大直径约为4 cm).同一时期的数个新鲜马铃薯洗净削皮，各取3～4片于液氮中研磨成粉，获得同一时期的混样，每个样品三个生物学重复.称取约0.2 g用于提取RNA，并反转录为cDNA.RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant Plus Kit为天根生化科技(北京)有限公司产品；cDNA反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser以及RT-qPCR所用 2×TB GreenPremixExTaqTMⅡ和50×ROX Reference Dye Ⅱ均为宝生物工程(大连)有限公司产品.RT-qPCR按照以下体积添加各组分：2×TB GreenPremixExTaqTMⅡ 10 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，正向引物(F)0.8 μL，反向引物(R)0.8 μL，稀释5倍的cDNA 2μL，ddH20 6 μL.RT-qPCR的反应程序为95 ℃ 30 s；40个循环：95 °C 5 s，60 ℃ 30 s.内参基因为Actin，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量[6].

表1 RT-qPCR所用引物

1.2 淀粉颗粒粒径分析

称取步骤1.1中得到的各时期马铃薯粉末0.1 g，加入800 μL ddH2O进行溶解，制得样液.称取2.0 g碘化钾及0.2 g碘溶于ddH2O中，100 mL容量瓶定容，制得碘-碘化钾染液.取样液-染液(体积比 3∶1)滴于载玻片上，染色后显微镜观察.根据放大倍数校正标尺后，测量所拍区域内淀粉颗粒的粒径.

2 结果

2.1 淀粉合成酶基因的组织表达特异性

Van Harsselaar等对马铃薯淀粉代谢相关基因进行了全基因组分析[3]，我们根据文献中提供的基因，结合其他文献报道的淀粉合成相关基因的功能，筛选了8个基因进行后续分析.利用Spud DB Potato Genomics Resource (http://spuddb.uga.edu/) 网站提供的Solanum tuberosum Group Phureja double-monoploid (DM) 转录组数据，分析了8个基因在块茎、匍匐茎及花等组织中的表达量(表2).结果表明，8个基因在块茎的表达远高于在其他组织的表达，说明所选的淀粉合成基因具有组织偏好性表达的特点.

表2 淀粉合成基因的FPKM值

2.2 块茎发育过程中淀粉合成相关基因的表达

利用RT-qPCR检测了淀粉合成相关基因的表达，结果如图1所示.淀粉合成相关基因在块茎7个发育时期的表达有3类模式：第一类是基因的表达在块茎发育时期变化较小，包括SS5、SS2和SBE3；第二类是基因的表达基本上随发育进程升高，但表达有波动，包括GPT2.1和SS3；第三类是随着块茎的发育，基因的表达逐渐增高，包括APL3、SuSy2和SuSy4.

Y1 到Y7表示块茎发育的7个时期.

2.3 块茎发育过程中淀粉颗粒粒径变化

通过碘-碘化钾染色和显微镜观察发现，随着马铃薯块茎发育，视野中大颗粒淀粉数量增多(图2).分别统计了块茎发育7个时期的206、109、257、166、87、144个和76个淀粉颗粒.对淀粉颗粒粒径< 20 μm、20～30 μm、30～40 μm和40～50 μm淀粉颗粒在颗粒总数中的占比进行分析，发现< 20 μm的淀粉颗粒占比逐渐降低，而20～30 μm、30～40 μm和40～50 μm的淀粉颗粒占比呈现逐渐增加的趋势，但< 20 μm的淀粉颗粒的比例始终是最大的(图3).

图2 块茎发育4个时期的淀粉颗粒粒径图片展示

图3 块茎发育7个时期的淀粉颗粒粒径统计

3 结语与讨论

淀粉生物合成是多种酶共同作用的结果.从DM的组织表达数据来看，淀粉合成相关基因具有块茎高表达的特征(表2).在块茎发育时期，虽然合成基因的表达模式不尽一致，但总体上具有发育后期表达高于发育前期表达的特点(图1).淀粉的合成不仅需要多种酶的参与，而且也受到转录因子的调控.在小麦、玉米和水稻等作物中已经报道了多种转录因子调控淀粉的合成[7].将合成基因作为指示基因，筛选出和指示基因具有共同表达模式的分析方法称为共表达分析.共表达分析是鉴定多基因代谢通路调控因子的有效方法.研究筛选的8个淀粉合成相关基因具有一致的组织偏好性表达模式，同时在块茎发育时期也具有后期表达高于前期表达的特征，将它们作为指示基因有利于进行组织或者发育时期共表达分析，从而筛选出转录调控因子.

小麦淀粉颗粒粒径的研究已较为深入，小麦淀粉颗粒以10 μm作为分界线，较小的圆形颗粒为B型，较大的盘状颗粒为A型，A淀粉粒与B淀粉粒在小麦中的比例约为1∶5[8].研究发现，A淀粉粒与B淀粉粒形成时期不同.A淀粉粒在开花后3～4 d开始形成，在生长过程中，胚乳中A淀粉粒数目保持不变，而体积逐渐增大；B淀粉粒直到开花后约15 d才形成，在生长过程中，颗粒大小基本不发生变化，但其数目一直增加[9-11].由于形成时期不同，A淀粉粒与B淀粉粒在很多淀粉理化性质方面也有所不同.例如，A淀粉粒比B淀粉粒具有更高的峰值黏度、最低黏度以及支链淀粉含量[8].Guo等详细研究了红薯块根中的淀粉颗粒，发现A、B和C三种淀粉颗粒在块根中共存[12].在马铃薯中尚未有详细的淀粉颗粒粒径研究[13].从发育时期来看，虽然随着块茎发育，大颗粒淀粉占比逐渐增加，但小颗粒淀粉仍占绝大部分(图2).后续还需要更详细地划分颗粒粒径大小，并对不同大小的淀粉颗粒进行深入研究.淀粉颗粒粒径受到遗传因素的影响，Feng等利用重组自交系定位了三个决定淀粉颗粒大小的数量性状位点[14].我们测定了部分二倍体马铃薯材料的淀粉颗粒大小，发现在淀粉颗粒粒径方面有较大的变异，因此后续有必要开展马铃薯淀粉颗粒粒径的遗传分析.

综上所述，淀粉合成相关基因在块茎中高表达，在块茎发育时期，后期表达要高于前期表达.在发育过程中，以小颗粒淀粉为主，大颗粒淀粉占比呈现出逐渐增加趋势.研究为进一步鉴定淀粉合成调控因子和淀粉颗粒粒径研究奠定了基础.