基于网络药理学探讨紫草-白鲜皮治疗带状疱疹的作用机制

付超群 周大标 石 全

(1. 湖北中医药大学， 湖北 武汉 430065； 2. 湖北中医药大学 附属湖北省中医院 皮肤科， 湖北 武汉 430061； 3. 湖北省中西医结合医院， 湖北 武汉 430015)

带状疱疹是由水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus, VZV)引起的感染性皮肤疾病，常表现为受累区域疼痛及单侧周围神经簇状水泡聚集，年龄增长和免疫抑制是VZV再激活的两个主要诱发因素。带状疱疹最常见的并发症是带状疱疹后遗神经痛，其复发率高，严重影响患者生活质量[1]。目前西医主要采取抗病毒、镇痛、营养神经及疫苗接种等对症治疗，但西药会产生严重不良反应[2]。

中医药是祖国医学的瑰宝，在带状疱疹治疗方面具有丰富经验并取得较好的临床效果。现代药理研究表明紫草、白鲜皮具有抗炎、镇痛及抗氧化等特性，可以改善带状疱疹患者生活质量，促进皮疹愈合，在减轻疼痛以及预防相关并发症方面疗效明确[3-4]。然而，由于中药成分的复杂多样性，目前有关紫草、白鲜皮治疗带状疱疹的确切机制仍不清楚。因此本文基于网络药理学对紫草-白鲜皮治疗带状疱疹的可能机制进行探讨，为临床治疗带状疱疹提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 紫草-白鲜皮有效成分筛选

在TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索紫草-白鲜皮有效成分，按照口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%，类药性(drug-likeness, DL)≥0.18的条件筛选[5]。

1.2 疾病靶点获取

使用OMIM、Disgenet、GeneCards以“herpeszoster”为关键词进行检索，获得相关疾病作用靶点。

1.3 药物疾病靶点筛选

在Venny 2.1在线软件将上述获得的药物与疾病靶点进行映射，获得紫草-白鲜皮治疗带状疱疹的潜在作用靶点。

1.4 构建药物-成分-靶点-疾病网络图

使用Cytoscape 3.8.2软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。

1.5 构建PPI网络

在STRING数据库中输入药物-疾病靶点并进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络。

1.6 GO和KEGG富集分析

基于R软件使用Bioconductor生物信息软件包进行关键靶基因的基因本体(gene ontology, GO)与京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)功能富集分析。

2 结果

2.1 中药、疾病化学成分筛选

在TCMSP数据库对白鲜皮-紫草的有效成分进行筛选，获得紫草潜在活性成分11个(见表1)，白鲜皮活性成分18个(见表2)。在OMIM、Disgenet、GeneCards数据库进行检索，筛选出645个药物靶点，去重后获得疾病靶点473个。绘制韦恩图，取交集后获得中药疾病共同靶点52个(见图1)。

表1 TCMSP数据库中保留的紫草药物活性成分表

表2 TCMSP数据库中保留的白鲜皮药物活性成分表

图1 白鲜皮-紫草与带状疱疹靶点韦恩图

2.2 中药-成分-靶点-疾病网络构建及分析

将中药紫草、白鲜皮中29个活性成分与52个药物-疾病靶点输入Cytoscape软件中，绘制“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图(见图2)。靶点关系显示白鲜皮、紫草主要有芋茵素、乙酰紫草素、谷甾醇、黄芩素及槲皮素等成分可发挥抗炎、镇痛、抗氧化及营养神经的作用，达到治疗带状疱疹的目的。

注：紫色代表中药紫草-白鲜皮，绿色代表中药24种活性成分，蓝色代表52个共同靶点，红色代表带状疱疹疾病

2.3 PPI蛋白相互作用网络构建

将上述52个共同靶点输入到STRING数据库中进行检索，获取靶点关系数据，将其导入Cytoscape软件，绘制PPI网络图(见图3A)。其中主要靶点有肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、磷酸化信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)、丝氨酸激酶(serine/threonine-protein kinase, AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3, MAPK3)、雌激素受体1(estrogen receptor 1, ESR1)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, MTOR)等(见图3B)，这些靶点与免疫调节、炎症、病毒基因复制、细胞增殖分化相关。

注：A：蛋白相互作用网络(节点的大小、颜色及其深浅变化代表degree值的大小)；B：基于PPI拓扑分析的核心靶点排序(degree排名前30)

2.4 GO与KEGG功能富集分析

使用R语言将中药紫草-白鲜皮与带状疱疹疾病的52个共同靶点进行GO与KEGG分析。GO通路获得1 465条生物学过程(如图4A)、50条细胞组分(如图4B)及79个分子功能(如图4C)，这三部分涉及细胞凋亡、物质合成转运及代谢等方面。KEGG功能富集获得146条通路，主要有人乳头瘤病毒感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、PD-L1在癌症中的表达和PD-1检查点通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用，其中排名前20的结果形成KEGG功能富集的条形图(如图4D)。药紫草-白鲜皮主要是通过这些通路增强免疫、抑制病毒复制，达到抗炎、止痛的作用。

注：A：GO富集分析生物学过程； B：GO富集分析细胞组分； C：GO富集分析分子功能； D：KEGG富集分析

3 讨论

针对带状疱疹的常规治疗，临床主要目标是缓解急性期疼痛、缩短皮损持续时间、防止皮损扩散、预防或减轻带状疱疹后遗神经痛等并发症，主要药物有阿昔洛韦、膦甲酸钠、普瑞巴林及糖皮质激素等对症治疗，但是对症治疗过程中，有相对较多的禁忌症并且远期效果不甚理想[6]。近年来中药由于具有疗效显著、服用安全等特点，受到持续关注。基于网络药理学，本研究表明紫草-白鲜皮含有的芋茵素、乙酰紫草素、谷甾醇、黄芩素及槲皮素等成分。研究表明，芋茵素抑制促炎细胞因子水平[7]；乙酰紫草素通过自噬途径使病毒颗粒失活显示出抗病毒活性及抗氧化特性[8]；谷甾醇通过抑制白介素-6和TNF发挥抗炎作用及免疫调节特性[9]；槲皮素能够阻止病毒进入或抑制病毒聚合酶复制[10]；黄芩素降低单纯疱疹病毒诱导的NF-κB和MAPK通路激活，减少病毒复制[11]。因此紫草-白鲜皮的中药成分主要是限制病毒复制对神经的损伤和降低炎症因子的释放，修复受损皮肤，从而达到抗病毒、抗炎、镇痛、抗氧化及营养神经等效果，以此达到治疗带状疱疹的作用[12]。

PPI构建靶点分析表明，紫草-白鲜皮治疗带状疱疹的主要靶蛋白是TNF、STAT3、AKT1、MAPK3、ESR1及MTOR等。TNF是反映机体免疫功能的重要细胞因子，参与机体内微环境的生理平衡，发生失衡就会诱发相关的免疫紊乱和异常，如TNF-α在带状疱疹病毒引起神经性疼痛的发生和进展中发挥着极其重要的作用[13]。STAT3蛋白在VZV感染的细胞中表达丰富，并且可通过免疫调节细胞因子IL-6来调节通路中的自噬因子[14]。AKT1是一种参与调节细胞生长、存活和增殖的多功能蛋白，在G1/S进展中起作用。AKT1参与细胞增殖和转化的调节，通过下游底物刺激细胞增殖，对细胞周期进程和调解具有多重影响；同时通过控制新陈代谢和蛋白质合成，AKT可确保细胞生长与细胞周期相协调，从而诱导细胞增殖[15]。MAPK的激活可上调自噬激活激酶1以控制线粒体自噬，除去功能失调的线粒体并减轻细胞氧化；MAPK和减数分裂有关，抑制基因表达及细胞增殖[16]。ESR是一种核受体超家族的转录因子，介导雌激素配体促进细胞生长和存活，是细胞增殖相关生理过程的重要调节剂[17]。MTOR蛋白激酶协调细胞生长的环境条件；MTOR还抑制CD8+和CD4+效应T细胞的分化和扩增[18]。这些关键核心蛋白分子发挥免疫调节、抑制炎症、降低病毒基因控制、调控细胞增殖分化和周期，从而达到改善VZV带来的不利影响。

GO生物功能富集分析表明紫草-白鲜皮药物成分的靶点蛋白对应基因分子功能主要涉及蛋白酶活性、磷酸酶及细胞因子受体等方面，生物过程涉及细胞胶质生成和酶活性的正向调节，细胞组分涉及膜筏、膜微域及膜区等，上述靶点蛋白主要与细胞凋亡、物质合成转运及代谢有关，其中酶活性在紫草-白鲜皮治疗带状疱疹中发挥重要作用。KEGG表明紫草-白鲜皮主要涉及的信号通路包括人乳头瘤病毒感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、PD-L1在癌症中的表达和PD-1检查点通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用。Epstein-Barr病毒和卡波西肉瘤相关疱疹病毒为了确保病毒基因组在细胞分裂过程中不会丢失，通过蛋白质中间体将病毒基因组连接到宿主有丝分裂染色体上[19]。PD-1的表达与T细胞功能受损、病毒载量增加和细胞凋亡敏感性增加有关。T细胞感染VZV会诱导PD-1表达，并且带状疱疹患者在再激活期间T细胞中的PD-1表达也会升高，PD-1通过与程序性死亡配体或PD-L2结合来引发其免疫抑制功能，大大降低免疫系统清除病毒的有效性。在VZV感染期间阻断PD-L1，将增强CD8+T细胞效应功能，导致IFNγ分泌水平显著升高，可以逆转VZV介导的免疫抑制，从而减弱与VZV相关的病毒传播和多系统疾病[20]。VZV再激活会产生血管病变和巨噬细胞升高，巨噬细胞中的AGE-RAGE相互作用诱导其向炎症表型激活，导致促炎介质过度产生，这是神经炎症和神经变性的主要原因。氧化应激参与AGE-RAGE的形成，AGEs激活RAGE和toll样受体，通过下游信号传导发挥其炎症作用，活化的巨噬细胞与一些代谢和炎症疾病的进展有关[21]。AGEs可与RAGE相互作用，导致某些信号通路的激活及细胞趋化因子和其他炎症介质的过量产生，最终诱发炎症，RAGE的过表达会触发NF-κB激活，进而介导炎症、细胞凋亡和增殖等细胞过程[22]。

综上所述，中药紫草-白鲜皮所含槲皮素、谷甾醇、乙酰紫草素、芋茵素、黄芩素等成分主要是通过病毒、PD-L1、AGE-RAGE信号通路控制TNF、蛋白激酶、激素受体等核心蛋白，使其跨过膜筏、膜区细胞膜，发挥抗氧化、抗炎、控制细胞自噬凋亡及抑制病毒复制的作用，从而达到治疗带状疱疹的目的。网络药理学表明中药治疗皮肤病有一定的优势，紫草-白鲜皮可通过多靶点及多途径作用于疾病的治疗中，本研究预测了紫草-白鲜皮治疗带状疱疹的潜在机制。但是需要更多的体内外实验验证，为临床使用提供更多新的证据支持。