三七丹参片通过免疫调节发挥对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用①

2022-10-02吴志焕河北工程技术学院石家庄050091

中国免疫学杂志 2022年15期

吴志焕（河北工程技术学院，石家庄050091）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由病毒感染引起的心肌炎性病变［1］。柯萨奇病毒B3（Coxsackie virus B3，CVB3）是VMC发生的主要病原体［2］。目前研究认为，CVB3直接攻击心肌细胞，引起的免疫病理损伤及心肌炎症反应，是导致VMC心肌细胞凋亡及坏死的主要原因［3］。故免疫治疗是VMC的主要治疗方式［4］。中医药在调节机体免疫力的同时还具有抗病毒作用［5］。近来研究发现，三七丹参片具有抗心肌缺血/再灌注损伤功能，还可增强机体免疫力［6-7］。但三七丹参片是否能通过调节机体免疫来治疗VMC目前尚不明确。本研究拟建立VMC小鼠模型，从免疫调节方面对此进行验证，以期为三七丹参片的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物来源健康雄性BALB/c小鼠90只，4～8周龄，体质量16～18 g，购自吉林大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（吉）2020-0003。本实验由河北医科大学实验动物福利伦理委员会（IACUC）批准（批号：IACUC-105061），并遵循《实验动物使用指南》，符合3R原则。CVB3悬液由中科院武汉病毒研究所王汉中教授提供。

1.1.2主要试剂及仪器三七丹参片（贵州德良方药业股份有限公司，批号：Z20050068，规格：0.5 g/片）；利巴韦林（上海宝曼生物科技有限公司；批号：D3360）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，货号：G1120）；TUNEL检测试剂盒（上海信裕生物科技有限公司，货号：XYA113）；肌酸激酶同工酶ELISA试剂盒（滁州仕诺达生物科技有限公司，货号：SND-M192）；肌钙蛋白ELISA试剂盒（杭州铂赛生物科技有限公司，货号：MM-0427M1）、肌红蛋白ELISA试剂盒（上海西格生物科技有限公司，货号：XG-E101848）；IL-17、IL-10、维甲酸相关孤核受体γt（retinoic acid-related orphan receptor γt，RoRγt）、Treg转录因子叉头框蛋白P3（forkhead box protein 3，Foxp3）、泛素蛋白酶2（SUMO protease 2，Senp2）、Toll样受体-4（Toll-like receptor-4，TLR4）、果蝇双翅边缘缺刻同基因1（drosophila double-wing edge notch homologous gene 1，Notch1）等抗体（美国Abcam公司，货号：ab79056、ab225820、ab41174、ab215206、ab58418、ab217274、ab52627）；自动凝胶成像分析系统（美国伯乐公司，型号：Gel Doc EZ）；荧光显微镜（美国奥林巴斯公司，型号：CX43）；超声诊断扫描仪（加拿大VisualSonics公司，RZ-VEVO 3100）。

1.2方法

1.2.1病毒性心肌炎小鼠模型的建立及分组给药取BALB/c小鼠，参照文献［8］腹腔注射CVB3病毒悬液100 μl，连续3 d，1次/d，制备VMC模型。超声心动图检测心功能指标心脏射血分数（ejection fraction，EF）和心率（heart rate，HR），HR及EF异常降低视为造模成功。共造模成功75只小鼠，随机分为模型组、三七丹参片低（0.43 g/kg）、中（0.86 g/kg）、高（1.72 g/kg）剂量组及阳性对照组（利巴韦林，1 mg/kg），每组15只，另取15只小鼠，不做任何处理，正常喂养，作为正常对照组。三七丹参片参照文献［7］设置剂量并进行配制后，灌胃给药，1次/d；利巴韦林参照文献［8］经腹腔注射给药1次；正常对照组及模型组灌胃及腹腔注射等量相应溶剂（羧甲基纤维素钠、生理盐水），各组均连续给药7 d。给药期间，统计小鼠死亡及饮食活动等一般状况。

1.2.2小鼠心功能指标检测参照文献［9］用超声心动图检测小鼠心脏EF、HR。

1.2.3小鼠血清心肌损伤相关指标检测麻醉小鼠，取腹主动脉血3 ml，3 000 r/min离心10 min，取血清，按ELISA试剂盒说明书检测肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白、肌红蛋白水平。

1.2.4小鼠免疫功能检测麻醉处死后解剖小鼠，将心脏组织分成两部分，一部分置于-80℃冰箱保存，另一部分置于4%多聚甲醛中固定备用。取小鼠新鲜脾脏参照文献［8，10］方法用流式细胞仪检测小鼠脾脏中CD4+T/CD8+T、Th17/Treg。

1.2.5HE及TUNEL染色检测心肌组织病理变化和心肌细胞凋亡率取1.2.4项下4%多聚甲醛中固定的组织标本，常规处理后切成5 μm的切片。取部分切片按HE及TUNEL试剂盒说明书方法分别染色、封片后，置于显微镜下观察组织变化。采用Image J软件检测凋亡细胞数目，并计算细胞凋亡率。

1.2.6免疫组化法检测心肌组织RoRγt、Foxp3阳性表达水平取1.2.5项下部分切片，抗原灭活修复后，加入一抗（RoRγt、Foxp3，1∶500）室温孵育4 h后，加入二抗（1∶500）室温孵育，DAB显色后置于显微镜下观察拍照，并采用Image J软件检测心肌组织中各蛋白阳性表达的平均光密度值。

1.2.7免疫荧光法检测巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）在心肌组织中的表达水平取1.2.6项下剩余组织切片，经曲拉通透化后，加入一抗（兔抗MIF，1∶500）4℃孵育过夜，加入TRITC标记的二抗（山羊抗兔IgG，1∶200）孵育显色后，荧光显微镜下观察并拍照，以Image J图像分析系统检测MIF表达荧光水平。

1.2.8Western blot检测心肌组织中IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1蛋白表达取1.2.4中-80℃保存的心肌组织300 mg，4℃解冻后，冰上匀浆、离心分离后，取上清液，BCA法定量蛋白浓度后，取100 μg蛋白进行电泳、转膜反应，加入IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1一抗（1∶2 000）、β-actin内参抗体（1∶3 000），4℃孵育过夜后，加入二抗（1∶2 000），37℃孵育4 h后，采用增强化学发光法显色，以化学发光仪观察条带并拍照，并以Image J软件分析各组蛋白相对表达水平。

1.3统计学分析采用SPSS21.0软件进行数据统计分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用SNK-q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1三七丹参片对小鼠一般行为的影响正常对照组小鼠无死亡，行为活动正常。模型组小鼠有8只死亡，活动量及饮食减少，解剖后观察心脏呈白色点状或条索状病变。丹参三七片低、中、高剂量组小鼠死亡数分别为5只、3只、1只，阳性对照组有3只小鼠死亡，且各治疗组小鼠饮食及活动量均有所增加。

2.2三七丹参片对小鼠心功能的影响与正常对照组相比，模型组小鼠心脏EF、HR降低（P＜0.05）；与模型组相比，三七丹参片各剂量组及阳性对照组HR、EF升高（P＜0.05），且三七丹参片剂量越高上述指标变化越明显（P＜0.05）；阳性对照组与三七丹参片中剂量组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表1。

图1 小鼠心脏超声心动图Fig.1 Echocardiogram of mice heart

表1 各组小鼠心脏EF、HR比较（±s）Tab.1 Comparison of heart EF and HR of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 HR（Times/min）422.28±20.21 212.82±10.841）286.17±14.362）340.12±15.942）3）387.58±19.722）3）4）338.39±14.432）3）EF（%）78.93±3.28 51.60±2.461）59.43±1.382）66.57±3.012）3）74.78±3.122）3）4）66.19±3.052）3）

2.3三七丹参片对小鼠心肌损伤标志物的影响与正常对照组相比，模型组小鼠心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白、肌红蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，三七丹参片各剂量组及阳性对照组心肌损伤标志物降低（P＜0.05），且三七丹参片剂量越高上述指标变化越明显（P＜0.05）；阳性对照组与三七丹参片中剂量组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠心肌损伤标志物变化（±s）Tab.2 Changes of myocardial injury markers of mice in each group（±s）

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Creatine kinase isoenzyme/（U·ml-1）30.23±1.64 137.07±4.921）103.39±9.532）76.12±2.282）3）45.11±2.022）3）4）77.23±2.112）3）Myoglobin/（μg·L-1）80.02±4.01 584.12±10.141）403.26±13.122）223.53±10.142）3）164.39±8.132）3）4）228.09±10.352）3）Troponin/（μg·L-1）15.23±1.34 59.37±4.761）50.27±3.122）38.82±2.042）3）22.19±1.132）3）4）38.15±2.162）3）

2.4三七丹参片对小鼠心肌组织病理变化及心肌细胞凋亡率的影响正常对照组小鼠心肌细胞结构正常，无损伤。模型组小鼠心肌组织横纹模糊，心肌细胞水肿、胞浆疏松且淡染，炎症细胞浸润明显，心肌细胞凋亡率高于正常对照组（P＜0.05）。与模型组相比，三七丹参片各剂量组及阳性对照组小鼠心肌组织横纹逐渐清晰，心肌细胞坏死及炎症浸润等病理损伤逐渐缓解，心肌细胞凋亡率低于模型组（P＜0.05），且三七丹参片剂量越高心肌损伤越轻，凋亡率降低越明显（P＜0.05）；阳性对照组与三七丹参片中剂量组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表3。

表3 各组小鼠心肌细胞凋亡率比较（±s）Tab.3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis rate of mice in each group（±s）

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Apoptosis rate（%）9.19±0.91 45.63±2.241）36.25±1.492）28.18±1.042）3）16.24±0.722）3）4）29.29±1.432）3）

图2 各组小鼠心肌HE及TUNEL染色图（×200）Fig.2 HE and TUNEL staining of myocardium of mice in each group（×200）

2.5三七丹参片对小鼠免疫功能的影响与正常对照组相比，模型组小鼠Th17/Treg、CD4+T/CD8+T升高（P＜0.05）；与模型组相比，三七丹参片各剂量组及阳性对照组Th17/Treg、CD4+T/CD8+T降低（P＜0.05），且三七丹参片剂量越高上述指标变化越明显（P＜0.05）；阳性对照组与三七丹参片中剂量组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图3、表4。

表4 各组Th17/Treg、CD4+T/CD8+T比较（±s）Tab.4 Comparison of Th17/Treg and CD4+T/CD8+T in each group（±s）

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Th17/Treg 0.16±0.04 4.12±0.461）3.36±0.352）2.09±0.242）3）0.99±0.092）3）4）2.11±0.262）3）CD4+T/CD8+T 1.42±0.12 2.33±0.201）1.91±0.142）1.71±0.112）3）1.57±0.102）3）4）1.72±0.102）3）

图3 小鼠脾脏淋巴液中Th17及Treg转录因子Foxp3流式检测结果Fig.3 Flow cytometric detection results of Th17 and Treg transcription factor Foxp3 in mice spleen lymph

2.6三七丹参片对小鼠心肌组织MIF表达的影响与正常对照组相比，模型组小鼠MIF表达升高（P＜0.05）。与模型组相比，三七丹参片各剂量组及阳性对照组小鼠MIF表达降低（P＜0.05），且三七丹参片剂量越高上述指标变化越明显（P＜0.05）；阳性对照组与三七丹参片中剂量组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4、表5。

表5 各组小鼠MIF表达比较（±s）Tab.5 Comparison of MIF expression in mice of each group（±s）

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 MIF 1.09±0.11 2.93±0.241）2.35±0.242）1.88±0.182）3）1.44±0.122）3）4）1.89±0.152）3）

图4 各组小鼠心肌组织MIF免疫荧光染色图（×400）Fig.4 MIF immunofluorescence staining of myocardial tissue of mice in each group（×400）

2.7三七丹参片对小鼠心肌组织RoRγt、Foxp3阳性表达的影响与正常对照组相比，模型组小鼠心肌细胞RoRγt阳性表达升高，Foxp3阳性表达降低（P＜0.05）。与模型组相比，三七丹参片各剂量组及阳性对照组小鼠RoRγt阳性表达降低，Foxp3阳性表达升高（P＜0.05），且三七丹参片剂量越高上述指标变化越明显（P＜0.05）；阳性对照组与三七丹参片中剂量组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5、表6。

表6 各组小鼠心肌组织RoRγt、Foxp3阳性表达水平比较（±s）Tab.6 Comparison of RoRγt and Foxp3 positive expression levels in myocardial tissue of mice in each group（±s）

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 RoRγt 4.41±0.14 36.91±1.281）28.58±1.152）20.97±1.052）3）12.47±0.622）3）4）20.49±0.042）3）Foxp3 25.36±1.33 2.28±0.161）7.48±0.582）10.29±1.052）3）18.27±1.322）3）4）10.08±1.082）3）

图5 各组小鼠心肌组织RoRγt、Foxp3免疫组化染色图（×400）Fig.5 Immunohistochemical staining of RoRγt and Foxp3 in myocardial tissue of mice in each group（×400）

2.8三七丹参片对心肌组织中IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组小鼠心肌组织IL-17、IL-10、TLR4、Notch1蛋白表达升高（P＜0.05），Senp2蛋白表达降低（P＜0.05）。与模型组相比，三七丹参片各剂量组及阳性对照组小鼠IL-17、IL-10、TLR4、Notch1蛋白表达降低（P＜0.05），Senp2蛋白表达升高（P＜0.05），且三七丹参片剂量越高上述指标变化越明显（P＜0.05）；阳性对照组与三七丹参片中剂量组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表7、图6。

表7 各组小鼠心肌组织IL-17、IL-10、TLR4、Notch1、Senp2蛋白表达比较（±s）Tab.7 Comparison of protein expressions of IL-17，IL-10，TLR4，Notch1 and Senp2 in myocardial tissue of mice in each group（±s）

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 IL-17/β-actin 1.05±0.09 2.84±0.281）2.41±0.262）1.93±0.192）3）1.58±0.152）3）4）1.99±0.192）3）IL-10/β-actin 1.13±0.10 2.73±0.261）2.22±0.242）1.86±0.182）3）1.47±0.142）3）4）1.84±0.172）3）TLR4/β-actin 1.02±0.12 2.99±0.251）2.52±0.232）2.06±0.222）3）1.65±0.172）3）4）2.08±0.262）3）Notch1/β-actin 1.01±0.10 2.73±0.241）2.12±0.252）1.72±0.172）3）1.45±0.142）3）4）1.78±0.172）3）Senp2/β-actin 1.19±0.11 0.13±0.041）0.32±0.052）0.62±0.062）3）0.85±0.082）3）4）0.60±0.052）3）

图6 各组小鼠心肌组织IL-17、IL-10、TLR4、Notch1、Senp2蛋白表达免疫印迹图Fig.6 Western blot analysis of protein expressions of IL-17，IL-10，TLR4，Notch1 and Senp2 in myocardial tissue of mice in each group

3 讨论

新型冠状病毒、肠道病毒、腺病毒、流感病毒等均可诱发VMC［11-12］。CVB3诱导的VMC在临床上最为常见，严重时可导致患者出现心力衰竭或死亡等［13］。本研究通过腹腔注射CVB3建立VMC小鼠模型后发现，小鼠死亡率增高、心肌细胞坏死及炎症浸润现象严重，并伴随心功能指标心脏EF、HR的明显降低，以及心肌损伤标志物水平的异常升高，提示造模成功。大量研究发现，三七丹参片中的丹参、三七具有抗心肌损伤作用，且马婧等［14］发现丹参、三七也是抗新冠病毒的潜在药物，提示三七丹参片也可能是缓解VMC心肌损伤的潜在药物。本研究发现，随着三七丹参片剂量的升高，VMC小鼠死亡逐渐减少，心肌损伤及炎症浸润缓解明显，心功能损伤也得到显著改善，且三七丹参片高剂量组改善效果优于中、低剂量组及阳性对照组，证实了三七丹参片也可缓解CVB3感染诱发的心肌损伤，对VMC有较好的改善作用。

病毒感染攻击心肌等宿主细胞时，会诱发机体一系列的免疫应答及炎症反应。研究发现CVB感染宿主细胞后可导致反应性T细胞和抗体应答的产生，而心脏损伤后自身抗原的释放也可诱导抗原致敏的CD4+T细胞激活，CD4+T细胞激活后可通过激活巨噬细胞、中性粒细胞浸润加重心脏损害［15］；CHEN等［16］发现病毒感染产生的CD4+T和CD8+T可持续存在并导致心脏慢性炎症的发生，而调控CD4+T/CD8+T平衡可减轻VMC心肌损伤。免疫细胞中的Th17可促进巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润而发挥促炎作用，Treg可抑制炎症反应并维持免疫平衡，Treg与Th17比例失衡也提示机体免疫功能的紊乱。DAI等［17］发现，VMC小鼠体内存在Treg/Th17失衡；吕爱婷等［8］发现调节Treg/Th17平衡可缓解VMC小鼠心肌损伤，提示CD4+T、CD8+T、Th17、Treg等是参与机体免疫应答的关键因子，且与VMC的发生发展关系密切。本研究发现VMC小鼠体内存在CD4+T/CD8+T、Treg/Th17的失衡，以及心肌炎症因子IL-17、IL-10表达的升高和先天免疫力蛋白酶Senp2表达的缺失，提示VMC小鼠免疫功能失衡及炎症反应是引起心肌损伤的可能原因。三七具有抗炎、提高免疫功能作用，丹参具有抗细胞凋亡、抗炎、抗心肌损伤作用，张兴城等［7］及杨艳等［18］等发现由三七和丹参两种药物联合组成的三七丹参片具有较好的抗炎、免疫调节及抗细胞凋亡作用。本研究结果显示，三七丹参片剂量越高，CD4+T/CD8+T及Treg/Th17越趋向于平衡，Th17转录因子RoRγt在心肌组织细胞中阳性表达水平越低、Treg转录因子Foxp3在心肌组织中阳性表达越高、心肌细胞炎症因子释放越少、心肌细胞凋亡率越低，提示三七丹参片可能通过调节免疫平衡、降低炎症反应来缓解VMC小鼠心肌损伤及凋亡。

TLRs是巨噬细胞识别病毒、细菌等抗原微生物，激活机体免疫应答、激活抗原呈递，介导免疫炎症反应的主要通路。王芳洁等［19］发现抑制TLR4表达可缓解CVB3感染小鼠的心肌炎症损伤程度。MIF是炎症因子刺激巨噬细胞后释放的细胞因子，可抑制巨噬细胞游走、促进炎症反应、促进细菌及病毒的感染。DE SOUZA等［20］发现在呼吸道合胞病毒感染引起的肺组免疫炎症损伤过程中，抑制肺组织MIF表达可降低肺组织炎症损伤。Notch1是RoRγt的上游调节因子，李志萍等［21］发现Notch1信号激活可干预Treg/Th17分化平衡过程，且抑制Notch1激活，可降低支原体感染肺炎儿童肺组织免疫炎症损伤。本研究发现，CVB3感染小鼠后，也可激活Notch1、TLR4通路，并促进MIF在心肌组织中的表达，提示Notch1、TLR4通路激活也可能参与VMC小鼠免疫炎症反应过程。三七丹参片各剂量组小鼠心肌组织中Notch1、TLR4及MIF表达呈剂量依赖性降低，且高剂量组优于阳性对照组，提示三七丹参片改善VMC小鼠免疫功能及炎症损伤的作用可能与抑制Notch1、TLR4及MIF表达有关。

三七丹参片可能通过调节免疫功能，降低炎症反应来改善VMC小鼠心肌损伤及凋亡，且其降低免疫炎症反应作用可能与抑制Notch1、TLR4通路激活有关。但病毒感染引起的免疫炎症反应机制复杂，且靶点较多，三七丹参片对于免疫调节的靶向调控机制还有待深入研究。