天山雪莲口服液对类风湿关节炎的治疗作用及其机制研究①

王灵锐 丛珊 王钰铭 张晨曦 罗剑 罗莉（新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种发病机制尚不明确的慢性自身免疫性疾病，主要病理表现为持续性多关节滑膜炎症反应、进行性的软骨和骨骼的破坏甚至关节功能丧失［1］。RA在成年人群中的患病率为0.5%～1%，以女性患者居多［2］。RA的发病机制复杂，其中滑膜组织增生是引起RA软骨和骨骼破坏的最重要因素。最新研究发现，滑膜成纤维细胞自噬紊乱是RA的重要发病机制之一，在胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型中，滑膜成纤维细胞（RA synovial fibroblasts，RASFs）自噬水平升高，进而促进其增殖，最终导致滑膜增生，通过抑制滑膜组织自噬水平可减轻滑膜增生［3］。天山雪莲（sasussured involucrata，SI）是中国新疆天山西部地区的稀有草本植物，多年来常用于RA的治疗［4］。天山雪莲口服液（SI Oral Liquid，SIOL）主要由SI提取物组成，目前已广泛应用于RA的临床治疗，在改善RA患者关节疼痛、晨僵、关节肿胀、关节压痛方面效果明显［5］，然而其作用机制尚不明确。本研究通过建立CIA大鼠模型，从调节自噬角度，进一步探讨SI治疗RA的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠50只，鼠龄6～7周，体质量（200±20）g，购自新疆医科大学动物实验中心。

1.1.2主要试剂与仪器天山雪莲口服液（新疆天山莲药业有限公司，批号：20190901）；雷公藤多苷片（黄石飞云制药有限公司，批号：20200901）；牛源性Ⅱ型胶原蛋白（bovine typeⅡcollagen，CⅡ，Chondrex，Inc公司，批号：#20022）；弗氏完全佐剂（Sigma公司，CFA，批号：#SLCC6223）；JNK抗体、p-JNK抗体（Cell Signaling Technology公司，批号：#9252、#4668）；Bcl-2抗 体（Abcam公 司，批 号：ab59348）；Beclin-1抗体、LC3-Ⅱ抗体、β-actin抗体、辣根酶标记山羊抗兔IgG（Proteintech公司，批号：

11306-1-AP、14600-1-AP、20536-1-AP、SA00001-2）；BCA蛋白定量试剂盒（索莱宝公司，批号：No.20210419）；TG15高速离心机（四川蜀科仪器有限公司）；JY600C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.2方法

1.2.1CIA模型制备大鼠适应性喂养1周后，将CⅡ以2 mg/ml溶解于0.05 mol/L的乙酸中，并在等体积的CFA中乳化，以200 μl乳剂在足趾及尾根部1.5 cm处皮下注射进行初次免疫，初次免疫7 d后再次经皮下注射相同乳剂进行加强免疫，进而诱发CIA大鼠模型［6］。加强免疫后15 d（即初次免疫第21天）开始观察并记录关节病变程度，大鼠出现包括踝关节在内的全部足爪肿胀提示造模成功。

1.2.2分组及给药将50只大鼠平均分为健康对照组、阴性对照组、阳性对照组、SIOL低、高剂量组。除健康对照组外，其余各组采用CⅡ建立CIA模型，造模成功后，空白组和阴性对照组灌胃生理盐水（2 ml/d），阳性对照组灌胃雷公藤多苷片［20 mg/（kg·d）］［7］，SIOL低、高剂量组灌胃分别灌胃SIOL（0.5 ml/d、2.0 ml/d），共给药28 d。注：SIOL给药剂量根据人等效剂量换算公式得到，其中低剂量组为人等效剂量。

1.2.3观察大鼠一般情况并测量踝关节肿胀度

分别在造模前、给药第0天、第7天、第14天、第21天、第28天用游标卡尺测量大鼠左后踝关节直径，连续测量3次，取其平均值。肿胀度（%）=（dn-dt）/dt×100%，dt、dn分别代表致炎前后踝关节直径。

1.2.4HE染色观察关节滑膜组织病理形态表现

取大鼠踝关节，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后置于10%的EDTA溶液进行关节脱钙，脱钙完成后梯度浓度乙醇脱水，经包埋、切片、烘干、脱蜡、HE染色等步骤后，×100显微镜下观察踝关节病理改变。

1.2.5qPCR测定滑膜组织中JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3mRNA含量取大鼠膝关节内滑膜组织30 mg提取总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，按照试剂盒说明分别加入引物和SuperReal PreMix Plus等，qPCR反应条件：95℃15 min，95℃20 s，56℃20 s，40个循环。熔解曲线分析：温度62～95℃，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

1.2.6Western blot检测滑膜组织中JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达收集各组大鼠的膝关节滑膜组织，称取约20 mg，加入150 μl RIPA蛋白裂解液，匀浆离心后留取蛋白。采用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。每个样品取等量蛋白10 μg，采用SDS-PAGE电泳分离蛋白，电泳条件：90 V，20 min；130 V，1 h。随后以130 V、300 mA、2 h将电泳分离后的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入不同的兔抗大鼠一抗JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3、β-actin（稀释比例分别为1∶10 000、1∶10 000、1∶1 000、1∶10 000、1∶2 500、1∶5 000）4℃孵育过夜。洗膜后加入二抗（羊抗兔IgG按1∶9 000稀释）室温孵育2 h，TBST洗膜后ECL化学发光法显影检测，采用Image pro plus 6.0软件对条带灰度值进行量化分析。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行数据统计，计量资料间较符合正态分布的采用t检验，以±s表示，两组间资料比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1SIOL对CIA大鼠踝关节肿胀度的影响与健康对照组相比，灌胃后第7、14、21、28天阴性对照组大鼠踝关节肿胀显著升高（P＜0.01）；与阴性对照组相比，阳性对照组、SIOL低、高剂量组在灌胃后第21、28天可显著抑制CIA大鼠踝关节肿胀，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 SIOL对CIA大鼠踝关节肿胀度的影响Fig.1 Effect of SIOL on swelling degree of ankle in CIA rats

2.2SIOL对CIA大鼠踝关节病理组织学损伤程度的影响HE染色结果显示，健康对照组大鼠踝关节软骨、骨组织无破坏，关节面光滑，滑膜组织内无炎症细胞浸润；阴性对照组大鼠滑膜组织明显增生嵌入关节腔，有大量炎症细胞浸润；与阴性对照组相比，阳性对照组大鼠滑膜组织增生显著降低，趋于正常，炎症细胞浸润减少；SIOL低剂量组各病变改善不明显；SIOL高剂量组滑膜组织增生显著减轻，关节腔嵌入程度明显改善，炎症细胞明显减少（图2）。

图2 SIOL对CIA大鼠踝关节组织病理学影响（HE，×100）Fig.2 Effect of SIOL on histopathology of ankle in CIA rats（HE，×100）

2.3SIOL对CIA大 鼠JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3mRNA表达的影响与健康对照组相比，阴性对照组JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3mRNA表达均显著升高（P＜0.01）；与阴性对照组相比，阳性对照组和SIOL低、高剂量组JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3mRNA表达均降低，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），见图3。

图3 SIOL对CIA大鼠关节滑膜组织JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3 mRNA表达的影响Fig.3 Effects of SIOL on mRNA expressions of JNK，Bcl-2，Beclin-1 and LC3 mRNA in synovial tissues of CIA rats

2.4SIOL对CIA大鼠滑膜组织中JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达的影响Western blot检测JNK/Bcl-2/Beclin-1通路相关因子JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平，结果表明：与健康对照组相比，阴性对照组p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ相对蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与阴性对照组相比，阳性对照组、SIOL低、高剂量组p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ相对蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），各组JNK水平无明显差异，见图4。

图4 SIOL对CIA大鼠关节滑膜组织JNK、p-JNK、Beclin-1、Bcl-2、LC3-Ⅱ蛋白表达的影响Fig.4 Effects of SIOL on protein expressions of JNK，p-JNK，Beclin-1，Bcl-2，LC3-Ⅱin synovial tissues of CIA rats

3 讨论

CIA大鼠是目前研究RA常用的动物模型，其主要病理表现为滑膜炎症细胞浸润、滑膜增生、软骨破坏和骨侵蚀，这些病理学表现与RA相一致［8］。本研究中大鼠注射CⅡ21 d后，大鼠表现出关节肿胀度增加，HE染色滑膜组织增生，炎症细胞浸润，这些表现与既往研究报道一致［8］，提示造模成功。SIOL能减轻炎症细胞浸润和滑膜增生，减缓RA的关节破坏［9］。雷公藤多苷片具有免疫调节、抗炎等作用，是一种常用的RA治疗药物［10］。本研究选取雷公藤多苷片为阳性对照，结果表明SIOL高剂量组与阳性对照组之间JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3的表达水平差异较小，提示SIOL可作为雷公藤多苷片的替代疗法治疗RA。

自噬是一种重要的细胞内机制，通过降解细胞内病原体、受损细胞器和蛋白质聚集体来维持细胞和组织的稳态和完整性［11］。最近的研究表明，自噬与RA滑膜成纤维细胞（RASFs）有关［12］。生理情况下，RASFs自噬处于较低水平，病理情况下，RASFs自噬水平升高进而导致滑膜增生，加重RA病程［13］。JNK/Bcl-2/Beclin-1通路是自噬启动的重要途径，c-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在内质网上，JNK被磷酸化激活后，导致抗凋亡蛋白Bcl-2活化，使Beclin-1从Bcl-2-Beclin-1复合物解离，游离的Beclin-1可启动自噬过程，使胞质形式的LC3（LC3-Ⅰ）通过与磷脂酰肌醇结合形成膜结合形式的LC3（LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ逐渐聚集并定位于自噬体膜上直到与溶酶体融合［14-15］。RA模型大鼠滑膜组织中自噬通路显著上调，进而导致滑膜增生［3］。本研究发现，阴性对照组关节滑膜组织中p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3蛋白表达水平均高于健康对照组，提示RA大鼠JNK/Bcl-2/Beclin-1通路被激活，自噬水平升高。SIOL灌胃28 d后，RA大鼠p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3蛋白表达水平均下降，提示SIOL干预后，RA大鼠JNK/Bcl-2/Beclin-1通路被抑制，细胞的自噬活动降低，从而改善RA症状。

综上所述，SIOL对CIA大鼠有一定的治疗作用，其机制可能与抑制JNK/Bcl-2/Beclin-1通路活性，进而抑制滑膜组织自噬有关。