富血小板血浆凝胶促进大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合的机制研究

皮肤作为人体最大的器官，具有分泌汗液、排泄废物、维持体温、防止病原体入侵等多种功能

。皮肤的结构主要由表皮、真皮层和皮下组织组成。由火、热水或蒸汽引起的深部皮肤损伤在临床上常见。这些患者容易感染和代谢失衡，有时导致截肢甚至死亡

。因此，找到一种有效的解决方法，尽快愈合此类创面，显得尤为重要。富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）是全血经过二次低速离心分离而得到的血小板和血浆浓缩物，包含红细胞、白细胞和生长因子等物质,并已在颌面外科、心脏外科、整形外科、运动医学等领域取得了良好的治疗疗效

。大量临床数据表明，烧伤患者采用自体富血小板血浆凝胶治疗可以提高烧伤创面愈合率、减少创面愈合时间、减轻创面疼痛、改善愈合质量

。目前关于富血小板血浆凝胶促进烧伤创面愈合的相关机制尚不明确。本实验旨在通过建立大鼠深Ⅱ度烧伤模型，采用富血小板血浆凝胶治疗，通过观察创面愈合情况，炎症细胞和炎症反应、巨噬细胞表型的变化，初步探究富血小板血浆凝胶促进烧伤创面愈合的作用和可能机制。为富血小板血浆在烧伤创面治疗方面提供实验理论数据。

1 材料和方法

1.1 实验试剂与仪器：凝血酶购自Sigma公司，PerfectStart Green qPCR SuperMix购自全式金公司、RNase inhibitor、dNTPs、RevertAid Reverse Transcriptase购自Thermo公司、TNF-α、IL-10、TGF-β

、PCR引物购自上海生物工程公司、iNOS抗体及CD206抗体、羊抗兔IgG二抗购自Servicebio公司。实时荧光定量PCR仪（ABI Q1）、PCR仪（北京东林昌盛科技有限公司）、切片机（莱卡）、包埋机（莱卡）、显微镜（尼康）、低温高速离心机（德国Thermo公司）。

1.2 实验动物：6～8周龄雄性SD大鼠，平均体重180～220 g，购自济南彭悦实验动物繁育有限公司[动物合格证：SCXK(鲁)20190003]，饲养在青岛大学附属医院SPF实验室[SYXK(鲁)20150003]，并在安静，通风、恒温的环境下饲养，相对湿度50%，12 h光暗交替。独笼饲养，自由进水，喂食大鼠原用饲料，定时更换垫料。本实验经青岛大学附属医院实验动物伦理委员会审核、批准。

1.3 烫伤模型的建立：大鼠适应性饲养1周后，将大鼠背部皮肤剪毛，用苯巴比妥（3.5 ml/kg）腹腔麻醉后，将小鼠置于俯卧位，将四肢固定在大鼠固定板上，使背部皮肤较平坦。室温（20℃～25℃）下，将带有刻度的两端无堵头、内直径约2.8 cm的中空塑料管直立于大鼠背部，其一端与大鼠备皮处皮肤紧密接触，另一端向管内注入沸水(约97℃～100℃)至2 ml刻度线处，沸水与皮肤持续接触约8 s后，立刻将沸水倒出。随后给予大鼠腹腔内注射5 ml复方氯化钠注射液抗休克，待大鼠苏醒。烫伤深度经24 h后病理验证。

1.4 富血小板血浆凝胶制备：另取SD大鼠12只，严格执行无菌操作，腹主动脉取血10 ml，采用二次离心法，第一次以200 g，4℃条件下，离心15 min，取全部上清液及交界层以下3 mm移至另一离心管，摇匀，第二次以500 g，4℃条件下，离心10 min，弃上层约3/4的贫血小板血浆，剩下1/4下层为少量红细胞、血浆、血小板混合物约1 ml为PRP。按体积9:1的比例加入凝血酶1 000 U/ml的激活剂，室温下5～6 s成凝胶状态。

2.1 深Ⅱ度烫伤模型建立：正常皮肤光镜下观察皮脂腺、毛囊结构完整，皮肤层次清晰，排列有序呈编织状。烫伤后24 h病理切片显示大鼠皮肤结构不清，坏死，真皮层胶原纤维变性，部分皮肤附属器的细胞发生核固缩，偶见残存毛囊，皮肤与皮下组织分离明显，创面毛细血管扩张，管腔内可见红细胞及血液瘀滞。符合深Ⅱ度烧伤的病理组织学改变，表明本次深Ⅱ度烧伤模型造模成功。见图1。

1.5 分组及给药：将建模成功的大鼠随机分为两组，实验组、对照组各9只大鼠。实验组采用PRP凝胶涂抹，范围大于创缘2 mm，厚度0.5～1 mm，均匀涂抹后再用凡士林纱布固定，每个创面约0.2 ml，隔日换药1次。对照组予以生理盐水清洗创面后，凡士林纱布覆盖创面，再用敷贴固定，正常饲养共14 d。分别于治疗后第3、7、14天，每组随机选取3只大鼠，CO

窒息处死后，创面加标尺垂直拍照，创面组织取材。

1.6 动物大体观察及愈合率计算：照片采用Image pro plus 6.0图像处理软件统计创面面积。按以下公式计算愈合率。创面愈合率（%）=（原始创面面积-当天创面面积）/原始创面面积×100%。

1.1 0 统计学分析：SPSS 22.0软件分析实验数据，计量资料采用均数±标准差表示，行

检验，

＜0.05为差异具有统计学意义。

再次，不仅语境是分析文学作品语言特色的关键性因素，而且，作者的写作个性也是说明其语言特色的关键所在。但这一点却被大多数的研究者所忽视。因为，一个作者的创作风格，不仅体现其小说创作的选材里，体现在小说人物形象体系的设计中，而且还体现在其创作的重要媒介——语言运用上。在小说《警察和赞美诗》中，作者的修辞运用别具特色。例如：

1.9 qPCR检测：取治疗后第3、7、14天创面组织，采用qPCR技术检测炎症反应相关因子TNF-α及抗炎相关因子IL-10、TGF-β

的表达。使用Trizol法提取各组创面总RNA，反转录为cDNA后，按照SYBR GREEN 1MIX说明书顺序加入反应试剂、引物及cDNA，进行PCR反应。采用2

法计算目的基因相对表达量，以GAPDH做为内参。各基因引物序列见表1。

六是加大了对口帮扶的力度。组织上海、江苏、浙江、山东对口帮扶云南，北京、天津、湖北、安徽对口帮扶贵州，广东、福建对口帮扶广西，并从七大流域机构和部直属科研单位抽调140多名水文地质、物探、水工等方面的专家指导抗旱，调集50多台（套）钻机、地质探测仪、泥浆泵等设备运赴重旱区找水打井。

1.8 免疫组织化学分析：取治疗后第3、7、14天组织切片，经脱蜡至水、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、后切片用iNOS(1:1 000)标记M1型巨噬细胞，CD206（1:500）标记M2型巨噬细胞，4℃过夜孵育，PBS洗剂3次，二抗山羊抗兔（1:300）室温孵育50 min，最后DAB显色并苏木素复染细胞核，于400倍镜下观察iNOS，CD206的表达。图像中棕色或棕黄色的为阳性细胞，每张片子随机取5个视野，计数阳性细胞数，取均值。

1.7 炎症细胞的半定量分析：治疗后第3、7、14天，各组创面组织PBS冲洗后置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，切片，片厚4 μm。HE染色。于400倍镜下随机选取5个视野，每张图片计数蓝色深染的炎性细胞（单个核，圆形细胞），取5张图片炎性细胞数的平均值。同样方法得到第7、14天各组炎症细胞平均值。

2 结果

该类维修集约范式的维修主体为城市轨道交通车辆运营单位，突出特征为“自主”。即，城市轨道交通运营单位成立相应的机构或独立实体，自身承担车辆质保期后的维修活动。该维修集约范式最大的优点在于责任界定清晰，维修保障响应比较及时。缺点在于城市轨道交通运营公司要负责投入人力、物料等维修资源。

2.2 PRP凝胶对创面愈合率的影响：结果显示，治疗后第3、7、14天，两组大鼠的创面愈合率均随着观察时间延长而升高，实验组创面愈合率显著高于对照组，差异具有统计学意义（

＜0.05）。PRP凝胶可促进大鼠烫伤创面的愈合，且创面炎症反应及组织液渗出均明显好于对照组，见图2，表2。

只得慰藉于苏珊娜与浮西努相同的身世，神似的气质，假借战争的苦难造成人物情感的偏执走向，并且借弗希里的口：“人在最无助的时候，爱情最容易入侵。在最危险的时候也是，这像嗜酒一样。”

2.3 对创面炎症细胞的影响：镜下观察可见，在治疗后第3、7、14天，两组创面炎症细胞均呈减少趋势，对照组创面可观察到更多的炎症细胞。实验组炎症细胞数显著低于对照组，差异具有统计学意义（

＜0.05）。见图3，表3。

“他们夫妻之间吵架，和你有什么关系？”我父亲说着抓住了我的袖管，要把我往书房里拉，我拒绝进父亲的书房，我说：“他们打起来了……”

2.4 免疫组化结果：镜下观察两组创面组织中，iONS阳性细胞胞质部分棕黄色深染，治疗后第3，7，14天，两组iNOS阳性细胞（M1型巨噬细胞）逐渐减少，但实验组明显比对照组少，差异具有统计学意义（

＜0.05）。镜下观察两组创面组织中，CD206阳性细胞胞质棕黄色深染，治疗后第3，7天，两组CD206阳性细胞（M2型巨噬细胞）逐渐增多，治疗后第14天两组创面阳性细胞数目较前有所减少，实验组阳性细胞数目明显多于对照组，差异具有统计学意义（

＜0.05）。见图4～5，表4。

2.5 qPCR检测结果：治疗后第3、7、14天实验组创面组织TNF-α mRNA相对表达量持续降低，在各个时间段，实验组TNF-α mRNA相对表达量显著低于对照组，差异具有统计学意义（

＜0.05）。IL-10 mRNA相对表达量则持续升高，在各个时间段，实验组均高于对照组，差异具有统计学意义（

＜0.05）。实验组TGF-β

mRNA相对表达量在第3天升高，实验组高于对照组，差异具有统计学意义（

＜0.05）；在第7天实验组TGF-β

mRNA表达量低于对照组，差异具有统计学意义（

＜0.05）；在第14天TGF-β

mRNA表达明显下降，实验组TGF-β

mRNA表达量低于对照组，差异具有统计学意义（

＜0.05）。见图6。

3 讨论

烧伤创面的愈合过程复杂，在其愈合过程，需要细胞之间、细胞与细胞外基质及细胞因子间相互影响和相互协同。伤口部位的炎症反应是影响愈合的重要决定因素。与非烧伤创面的愈合过程相比，烧伤创面愈合较晚，炎症细胞因子水平较高，血管生成较差，基质沉积较少

。

PRP可以通过分泌生长因子、细胞因子、趋化因子等炎症介质以及趋化因子的表达调节创面的炎症反应

。激活的PRP表现出良好的促炎因子和抗炎因子的平衡，并通过调节损伤部位的主要炎症细胞（中性粒细胞和巨噬细胞）的分泌和招募，推动创面炎症反应的进程，促进创面炎症期尽快结束转向增殖期和重塑期

。本研究中炎症细胞计数结果表明，与对照组相比，激活的PRP凝胶可明显减少创面炎症细胞浸润，预防炎症状态持续，使创面尽快进入修复状态。

烫伤后的创伤修复初期，创面局部皮肤组织因创面微循环障碍和过度炎性反应，导致TNF-α等因子水平提升，微循环障碍又可导致局部炎症因子和代谢产物堆积，导致创面炎症加重

。TNF-α的升高不仅导致肉芽组织的生成减少，还抑制TGF-β对细胞外基质刺激的产生。PRP可通过抑制促炎信号通路和释放抑炎因子，从而抑制过度的炎症反应，促进创面愈合

。PRP中含有中性粒细胞可激活蛋白-2、基质细胞衍生因子-1α等抑菌因子及白细胞、单核细胞等血细胞成分，上述成分均在机体抗炎及增强免疫方面具有重要作用，可增强机体对炎症的控制而降低各炎症因子的表达水平

。PRP还可通过微小RNA-21/PDCD4/核因子κB信号通路减少促炎因子TNF-α的表达，提高抗炎因子IL-10、TGF-β

水平而发挥直接抑制炎症作用

。本实验检测表明烫伤后随着愈合时间延长，各组TNF-α mRNA的表达水平逐渐降低，实验组TNF-α mRNA的表达水平显著低于对照组。相反创面抗炎因子IL-10 mRNA升高，表明经过PRP凝胶治疗后，烫伤创面促炎因子和抗炎因子的表达谱发生转变，将细胞因子由促炎谱向抗炎谱转变。TGF-β是一种多功能细胞因子,不仅具有抗炎作用，而且可以诱导成纤维细胞增殖和细胞外基质成分的合成，导致组织纤维化

。本研究结果发现PRP凝胶可能通过在前期提高TGF-β

表达，促进创面愈合，治疗后期表达的下降可使瘢痕组织形成风险下降。

(1)尾砂粒度及成分组成。尾矿库中尾砂按粒度划分，以粉砂为主，平均粒径d50=0.04～0.1 mm，加权平均粒径dp=0.05～0.15 mm，不均匀系数Cu=3～4，粘粒含量1%～5%，局部大于20%。尾砂物质主要成分是石英，其次是难选铁氧化物，再次是少量的绿泥石和碳酸盐类矿物。

在皮肤伤口愈合过程中，活化的巨噬细胞是炎症反应的主要参与者和伤口修复的关键调控因子，并对创面其他细胞的功能及状态产生影响

。创面中的活化巨噬细胞主要为两种极化状态，M1（促炎性）和M2（抗炎性），在炎症期，M1型巨噬细胞以促进创面炎症为主，分泌大量的炎症及促炎症因子TNF-α，IL-1，IL-6和iNOS,主要作用是吞噬凋亡的细胞残片、细菌及异物，同时调节淋巴细胞、树突状细胞等免疫细胞的炎症功能，在增殖和重塑期以M2型巨噬细胞为主，高表达抗炎因子IL-10以及多种生长因子TGF-β

，VEGF和PDGF，刺激成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞分化、增殖和迁移，促进胶原沉积、促进血管化和肉芽组织增生促进组织重建

。烫伤后创面的巨噬细胞偏向M1型，在创面发生感染或创面条件不可控时，巨噬细胞炎性反应就会增强,从而加重烫伤程度，延迟创面愈合

。Kim等发现PRP能降低核因子-κB（NF-κB）的转移活性，而NF-κB则是巨噬细胞向M1型极化过程中重要的调控因子

。陈潇通过体外实验推断出PRP可能不仅依赖PRP本身所含的大量生长因子，它还可以激活JAK1/3-STAT6通路促进巨噬细胞向M2型转化，通过调节巨噬细胞的活化状态以促进创面愈合

。刘宸发现PRP能聚集并趋化大量巨噬细胞向非炎症表型分化，抑制炎性因子表达，促进抗炎性因子表达

。本研究结果显示，治疗后第3、7、14天，实验组M1型巨噬细胞数量均少于对照组；治疗后第3、7、14天，实验组M2型巨噬细胞数量均多于对照组，因此笔者认为，PRP可以促进烫伤创面中的巨噬细胞从M1型向M2型转化，进而促进创面的愈合，与之前研究结果相一致。

综上所述，PRP凝胶可有效促进大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合，可能与减少创面炎症细胞浸润，调节创面炎症反应及巨噬细胞表型有关。其促进创面愈合的机制仍需进一步研究。

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