载VEGF肝素化HA-TCP明胶支架的理化性能及其生物学效应初步评价

陈倚天，陈 旭，黄艳霞，董星月，张栋梁

颌骨缺损是口腔科常见的疾病之一，如唇腭裂、牙槽突裂、创伤导致的牙槽骨缺损等。修复材料主要有自体骨、异体骨和人工替代材料等。自体骨需开辟第二术区且量有限，异体骨和人工骨替代材料促血管化不足，不具备诱导骨生成的能力。肝素化羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatite-tricalcium phosphate，HA-TCP)明胶支架是一种新兴的组织工程骨，通过体外构筑支架材料-种子细胞-生长因子复合物，实现骨的形态和功能上的修复。课题组前期从模拟天然骨形态角度出发，构建复合材料支架。本研究在支架材料上装载血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，并用不同浓度的肝素对支架材料进行处理，评估其理化性能、VEGF负载率和缓释效果、抑菌能力，对其诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)成骨分化能力进行检测，为临床应奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和设备

1.1.1 主要试剂 肝素钠(索莱宝，中国)；rhVEGF 165(R&D，美国)；牛血清白蛋白(Sigma，美国)；人VEGF Elisa试剂盒(欣博盛，中国)；人骨髓间充质干细胞(ATCC，美国)；间充质干细胞培养基(ScienCell，美国)；α-MEM培养基(Gibco，美国)；特级胎牛血清FBS(Gibco，美国)。

1.1.2 主要设备 电子万能机(MTS，美国)；扫描电子显微镜(HITACHI，日本)；全自动比表面积孔隙度分析仪(Micromeritic，美国)；冷冻干燥机(Scanvac，丹麦)；酶标仪(SPECTRA，美国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；微生物培养箱(ThermoFisher，美国)；自动细胞计数仪(Invitrogen，美国)；激光共聚焦显微镜(Leica，德国)。

1.2 HA-TCP明胶支架的物理结构 (1)扫描电镜观察HA-TCP明胶支架表面形态、孔隙大小和分布，Image-J软件测量孔隙大小。支架制成圆柱体(φ14.5 mm×14.5 mm)，电子万能机测量其压缩强度，计算弹性模量。(2)HA-TCP明胶支架碾磨成颗粒冻干收集，自动比表面积分析仪测试支架BET比表面积(介孔)(50 ℃，8 h)，绘制吸附脱附曲线、比表面积图、孔容、孔径分布图。

1.3 HA-TCP明胶支架的VEGF装载率与释放速率 实验分组：肝素化HA-TCP明胶支架材料组(H0.5组：肝素浓度0.5 mg/ml；H1.0组：肝素浓度1.0 mg/ml)，设立未进行肝素化HA-TCP明胶材料为空白对照组。取3组支架各10 mg(=6)称重(M)，超纯水浸泡30 min，滤纸吸干支架表面水分后称重(M)，计算吸水率：P=(M-M)/ M×100%。将支架浸泡于4 ℃的1 μg/ml VEGF溶液中24 h，收集上清液称重(m)。使用PBS冲洗，然后收集冲洗液称重(m)。将结合VEGF的支架浸泡于1 ml PBS溶液中，每隔24 h收集上清液称重，共14 d(m-m)，每组取3个10mg支架。酶标仪检测，设空白孔，标准孔，绘制标准曲线，计算回归方程，计算VEGF浓度，记为n(剩余上清液)、n(冲洗液)，n-n。

VEGF结合量=m-m×n/ρ-m×n/ρ；

VEGF释放量= d(n-14×m/ρ)。

1.4 HA-TCP明胶支架的抑菌性能 取金黄色葡萄菌悬液，在9个LB培养基平板上分别滴加100 μl，使用涂布器均匀涂布，再将三组样品(=3)圆片分别放入平板中心位置，37 ℃培养24 h后，Image-J软件测量抑菌圈直径。

1.5 HA-TCP明胶支架对BMSC生长的影响 BMSC常规培养，0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，计数。(1)细胞生长：HA-TCP明胶支架经环氧乙烷灭菌后，置于BMSC细胞悬液中，摇床震荡(37 ℃，1 h)，后静置4 h，再加入培养基培养3 d，4%多聚甲醛固定4 h后冻干，扫描电子显微镜观察细胞生长情况；(2)成骨分化：用α-MEM培养基制备三种支架浸提液，添加到成骨培养基中培育BMSC细胞，培养结束后，茜素红S染色液染色20～30 min，去离子水清洗，加入10%氯化十六烷吡啶1 ml，室温下孵育30 min，酶标仪(λ)测定吸光值。

2 结 果

2.1 HA-TCP明胶支架表征 HA-TCP明胶支架呈圆柱形，淡黄色，表面疏松多孔，质地较硬(图1A)。扫描电镜下可见支架表面清晰孔隙，孔径大小分布范围广，10～400 μm，孔间可见丰富的交通(图1B)。

2.2 HA-TCP明胶支架物理特征 HA-TCP明胶在以1 mm/min的速度加力情况下，支架未发生碎裂，符合塑性形变特征。在形变量0%～15%时，应力-应变曲线平滑；应力达0.76 MPa时，支架发生屈服。此后，支架逐渐被压缩，应力-应变曲线出现细小锯齿状波动，但应力趋势总体上升。当支架形变量达65%，应力达2.4 MPa时，支架塌陷，应力明显下降(图2A)。对曲线5%内的数据进行线性拟合计算，支架弹性模量0.93 MPa，支架屈服强度0.76 MPa，最大承压2.4 MPa。

2.3 BET比表面积测试 支架吸附脱附过程中吸附量-相对压力的曲线形态近似为Type V型等温线，在多层吸附过程中，发生毛细血管冷凝现象，吸附脱附曲线自0.25倍分压开始分离，直至接近1.0倍分压重新达到平衡(图2B)，符合大孔材料特征。支架介孔于2～50 nm之间，最大量孔径集中于20 nm处，平均大小为25.96 nm(图2C)，BET比表面积为(1.01±0.06)m/g(图2D)，介孔在10～28 nm时，脱附速度较快，随后基本平缓(图2E)。

2.4 HA-TCP明胶支架VEGF负载和释放 三组HA-TCP明胶支架的吸水率在组间均无统计学差异(>0.05)。空白组与H组和H组支架VEGF结合率之间均有显著差异(<0.05)，H组与H组差异无统计学意义(表1)。从支架VEGF释放量率-时间曲线可以看出(图3)，空白组自第1天起即释放迅速，第4天累积释放75%；在5 d后，H组释放曲线较平缓，释放速度明显减缓；7 d后H组释放曲线平缓，释放率低于空白组和H组，差异有统计学意义(<0.05)。

2.5 HA-TCP明胶支架的抑菌性能 空白组抑菌圈直径为(7.30±0.11)mm，H组抑菌圈直径为(9.67±0.20)mm，H组抑菌圈直径为(11.07±0.43)mm(=3)，三组间差异具有统计学意义(<0.05)，H组抑菌能力最强。

2.6 HA-TCP明胶支架对BMSC成骨分化的影响 扫描电镜下可见，细胞在HA-TCP明胶支架上生长良好，主要分布在材料表面，呈片状、岛状分布，表面有突触伸出，可见较多分泌颗粒(图4)。定量检测显示，H组和H组的钙化沉淀量高于空白组，差异有统计学意义(<0.05)。H组和H组无差异(图5)。

3 讨 论

3.1 支架理化性能对BMSC的影响 口腔颌面部骨无过大负载，对修复材料的绝对强度无过高要求，但是要求材料良好的可塑性和形态适应性。Logie等认为，支架应具有足够的机械完整性，以提供稳定的固定，支架的杨氏模量与宿主骨相似十分重要，可以避免潜在的应力遮挡。Discher等发现，支架的弹性还可以调节BMSC形态、增殖和分化行为。本研究制作的肝素化HA-TCP明胶支架，最大压缩强度2.4 MPa，小于松质骨，压缩强度可达到稳定的要求，满足临床使用，其弹性模量与松质骨大致相同，应力应变行为类似松质骨，无明显的屈服点，应力应变曲线较平直，最大压缩量可达65%，在植入过程中，可根据缺损形态塑形，可用于不规则区域的充填。这些特点保证了应力传递。

骨组织工程支架微观结构最重要的是孔隙率、孔径的大小以及孔与孔之间的连通性。支架的孔径大小取决于所设计的骨组织类型。较小孔径(直径<75 μm)适合纤维组织的形成，而中等孔径(直径在75～100 μm)适合未矿化骨组织的形成，较大孔径(直径>200 μm)适合全矿化骨组织的形成，血管化则需要大孔径(直径>300 μm)，适于细胞生长的材料孔径范围较大(直径50～1000μm)。本研究制作的支架孔径10～400 μm，分布范围广且均匀，满足血管化、细胞生长和成骨的要求。BET结果显示，除10～400 μm的孔径外，还存在15～25 nm的孔隙，利于细胞因子的交通、信号传递。

3.2 肝素和VEGF修饰支架对BMSC的影响 骨是一个高度血管化的器官，血管生成在成骨中起着重要的作用，VEGF是调控血管发育和血管生成的重要生长因子之一。血管生成增加带来了骨祖细胞以及矿化所必需的营养、氧气和矿物质。成骨因子，如BMP2，从血管释放，促进成骨细胞分化和矿化。而成熟的成骨细胞产生血管生成因子，如PDGF和VEGF，进一步支持血管生成。因此，调节骨内VEGF水平是治疗受损骨修复和改善骨再生的潜在策略。肝素模拟ECM中生长因子的结合方式，能有效保护生长因子活性。Xu等采用反相乳液聚合技术，合成了肝素修饰的透明质酸基水凝胶支架，BMP-2以恒定剂量接近零级释放，可有效促进MSCs软骨诱导形成。VEGF在血管形成中具有重要的作用，其作用依赖于体内适宜的释放浓度。研究证实，长期、稳定、剂量相对较低的VEGF含量可能具有更好的远期效果，只有当低浓度VEGF与高浓度BMP-2联用时才会促进骨形成，其原因在于VEGF有抑制BMPs/TGF-β下游的可能。本研究中的支架孔隙、介孔分布理想、吸水率高，物理吸附功能加好，提高了VECG结合率，也得出了相似结论。

3.3 支架的抑菌性 10%的骨缺损修复因细菌感染而失败，材料表面改性、修饰提高抑菌性也一直是植入材料的研究热点。本研究中支架材料具有一定的抑菌效果，与肝素修饰有关。肝素具有一定的抗菌活性，可与胶原形成类ECM结构，有效结合抗菌肽等生物蛋白，提高材料抗感染能力。

本研究结果表明，载VEGF肝素化HA-TCP明胶支架材料具有与天然松质骨相似的弹性模量和力学特性，压缩强度可满足临床需求，孔径分布范围广，肝素能显著提高VEGF载量，具有更强的抑菌能力，可促进血管再生，BMSC附着后生长良好，并表现较好的骨分化能力，是一种理想的骨缺损修复材料，有较好的临床应用潜力。

致谢：中国科学院长春应用化学研究所黄宇彬博士。