复方癸甲氯铵溶液的消毒效果评价

王文惠 ， 高 琛 ， 崔亮亮 ， 王 彬 ， 李贵玉 ， 张继甫 ，赵红琼 ， 王金泉 ， 李 康 ， 郝智慧

(1. 新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆 乌鲁木齐 830052 ； 2. 中国农业大学动物医学院 中兽医药创新中心 ，北京 海淀 100193 ； 3. 成都科宏达科技有限公司 ， 四川 成都 611435 ； 4.青岛农业大学 农用生物制药实验室 ，山东 青岛 266109)

随着畜牧养殖业集约化程度的不断提高，饲养密度不断加大，动物传染性疾病的传播速度加快，各种动物疫病层出不穷[1]。预防和控制畜禽传染病流行的重要措施之一即为使用消毒剂对畜禽及其周围环境进行消毒[2]。季铵盐类消毒剂是一类使用广泛的消毒剂，包括单链季铵盐和双链季铵盐两类[3]，其中双链季铵盐消毒剂比单链季铵盐的抗菌活性高[4]，且双链季铵盐具有杀菌作用快速、使用浓度低、毒副作用轻的特点[5]。将双链季铵盐和单链季铵盐组成复方消毒剂可提高杀菌效率、降低毒性、扩大杀菌谱、拓展产品的适用范围[6]。由于消毒剂的使用越来越广泛，生产上需要客观测定消毒剂的消毒效果，为临床应用提供较可靠的依据[7]。复方癸甲氯铵溶液为单双链季铵盐复方消毒剂，至今未见有关该产品消毒效果的评价研究，本试验根据相关技术规范，通过定性杀菌试验、定量杀菌试验、使用液稳定性试验和金属腐蚀性试验对复方癸甲氯铵溶液进行消毒杀菌效果评价，旨在为该复方消毒剂的临床应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 消毒剂 受试品：复方癸甲氯铵溶液，含苯扎氯铵(含量规格：95%，批号：1807050101)和癸甲氯铵(含量规格：70%，批号：1808155104)，淡蓝色透明液体，柠檬香气，实验室自制。对照品：癸甲溴铵溶液，规格：100 mL∶10 g，批号：190608。

1.2 试验指标菌 大肠埃希菌CICC 10899(等同于大肠埃希菌8099)、金黄色葡萄球菌CICC 21601(等同于ATCC 6538)，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.3 主要试剂 普通营养琼脂培养基、营养肉汤，均购自北京奥博星生物技术有限公司；中和剂(含0.5%卵磷脂和3%吐温-80的PBS溶液)，自制；有机干扰物(30 g/L牛血清白蛋白溶液)，自制；牛血清白蛋白(第五组份)，购自北京奥博拓达科技有限公司。

1.4 主要仪器 洁净工作台，苏州净化设备有限公司；高压灭菌锅，致微(厦门)仪器有限公司；浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；生化培养箱，上海恒一科学仪器有限公司；数显水浴恒温振荡器，金坛市科兴仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.5 菌悬液制备 在无菌条件下打开大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌冻干菌种管，加入适量营养肉汤混匀，将200 μL悬液加到含5.0 mL营养肉汤培养基的离心管中，37 ℃培养[8]。用接种环蘸取第1代菌液，接种在营养琼脂培养基平板上，37 ℃培养。挑取第2代培养物的单个菌落，接种于营养琼脂斜面，37 ℃培养18～24 h，为第3代培养物。吸取PBS溶液加入到斜面试管中洗下菌苔，移入另一离心管中混匀细菌悬液。用比浊测定法粗测细菌悬液的菌液浓度，然后用PBS溶液稀释至试验所需要的浓度。

1.6 中和剂鉴定试验 以大肠埃希菌作为试验菌，配制菌悬液，使其含菌量约为107CFU/mL并进行活菌计数。中和剂为含0.5%卵磷脂和3%吐温-80的PBS溶液，作用于试验菌10 min，(20±1) ℃水浴中待用。试验分为6个组：(1)复方消毒剂+菌悬液；(2)复方消毒剂+菌悬液+4.5 mL中和剂；(3)4.5 mL中和剂+菌悬液；(4)复方消毒剂+4.5 mL中和剂+菌悬液；(5)菌悬液+稀释液；(6)稀释液+中和剂+营养肉汤培养基。操作过程按照《消毒技术规范》中定量杀菌试验[8]进行，试验重复3次。

1.7 定性杀菌试验 在13支离心管中各加入2.5 mL无菌蒸馏水，取2.5 mL复方癸甲氯铵溶液最高使用浓度(原液稀释50倍)的稀释液，加入第1管中混匀，倍比稀释至第11管，第12管不加消毒剂作为阴性对照，第13管只加入复方癸甲氯铵溶液最高使用浓度(原液稀释50倍)的稀释液作为阳性对照。用PBS溶液将制备好的菌悬液稀释至5×105～5×106CFU/mL并进行活菌计数，第1～12管每管内加入2.5 mL菌悬液混匀后开始计时，分别作用5、10、15、30 min和60 min后，从第1～13管中分别取出0.5 mL加入含4.5 mL中和剂的离心管中，混匀后中和10 min，再从中分别取出0.5 mL加入含4.5 mL普通营养肉汤培养基的离心管中，37 ℃培养24 h，观察有无细菌生长[9]。

1.8 定量杀菌试验 用无菌硬水分别将复方癸甲氯铵溶液和对照消毒剂配制成含等浓度季铵盐物质的消毒使用液(配制浓度为待测浓度的1.25倍)。被试样品为复方癸甲氯铵溶液和对照消毒剂，对照样品为PBS溶液。用PBS溶液将制备好的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌悬液稀释至106～107CFU/mL，活菌计数后进行定量杀菌试验[8]，取无菌离心管加入0.5 mL试验用菌悬液和0.5 mL有机干扰物混匀，分别吸取被试样品和对照样品4.0 mL注入其中，作用2.5、5.0 min和7.5 min后吸取0.5 mL，加入到4.5 mL灭菌的中和剂中作用10.0 min，倾注融化的营养琼脂混匀，进行活菌计数，根据各组活菌数(CFU/mL)按公式(1)计算杀菌率。

杀菌率/%=[(对照样品平均菌落数-被试样品平均菌落数)/对照样品平均菌落数]×100%。

(1)

将各组的活菌数(CFU/mL)换算为对数值(N)，然后按公式(2)计算杀灭对数值[8]。

杀灭对数值 (KL)=对照样品平均活菌浓度的对数值(No)-被试样品平均活菌浓度对数值(Nx)。

(2)

1.9 使用液稳定性试验 将复方癸甲氯铵溶液用自来水稀释至使用浓度(1∶200)。每种浓度分别设置加盖组和敞口组。将稀释好的复方癸甲氯铵溶液200 mL分别装入4个500 mL的塑料杯中，室内温度为19～22 ℃。分别于第0、1、2天和第3天取出适量溶液测定pH并进行消毒效果检测，其中试验菌为大肠埃希菌，具体方法同定量杀菌试验[8]。

1.10 金属腐蚀性试验 将碳钢、不锈钢、铜和铝制成直径为24.0 mm、厚度为1.0 mm的圆片，中间做一直径为2.0 mm的小孔，使圆片的表面积总值约为9.80 cm2。将圆片在洗涤剂中浸泡10 min后清洗；用120号粒度水砂纸磨去氧化层，再用自来水冲净。测量圆片的孔径、厚度、直径，用无水乙醇浸泡脱脂。置于50 ℃恒温箱干燥中1 h，称重后浸泡于200 mL复方癸甲氯铵溶液最高使用浓度(原液稀释50倍)的稀释液中，蒸馏水为对照组。连续浸泡72 h后取出圆片，用自来水和毛刷清洗干净，滤纸吸干，置50 ℃恒温干燥箱中1 h后称重，按公式(3)计算腐蚀速率 (R)[8]，腐蚀性分级标准见表1。

表1 腐蚀性分级标准Table 1 Corrosion classification standards

(3)

式中R表示金属腐蚀速率，mm/a；S表示金属片总表面积，cm2；t表示时间，h；d表示金属材料密度，kg/m3；m表示试验前金属片重量，g；mt表示试验后金属片重量，g；mk表示化学清除去除腐蚀产物金属片失重值，g；试验中若未进行化学清除处理，计算时在公式中删去mk。

2 结果

2.1 中和剂鉴定 结果如表2所示，用含0.5%卵磷脂和3%吐温-80的PBS溶液作为中和剂，可以有效中和复方癸甲氯铵溶液对大肠埃希菌的残留作用，且中和剂及其中和产物对试验菌的生长和培养基无影响。

表2 中和剂鉴定试验结果Table 2 Neutralizer identification test results

2.2 定性杀菌试验 复方癸甲氯铵溶液对大肠埃希菌的最低有效杀菌浓度为1∶12 800，该浓度下杀菌最快有效时间为10 min；对金黄色葡萄球菌的最低有效杀菌浓度为1∶25 600，该浓度下杀菌最快有效时间为10 min，见表3。

表3 定性杀菌试验结果Table 3 Qualitative sterilization test results

2.3 定量杀菌试验 复方癸甲氯铵溶液和对照消毒剂癸甲溴铵溶液对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌分别作用2.5、5.0 min和7.5 min，结果见表4、表5。复方癸甲溴铵溶液作用2.5 min可有效杀灭大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，平均杀灭对数值均≥5；癸甲溴铵溶液作用7.5 min以内无法完全杀灭大肠埃希菌，作用2.5 min可有效杀灭金黄色葡萄球菌，平均杀灭对数值均≥5。

表4 定量杀灭大肠埃希菌的杀菌率及杀灭对数值Table 4 Bactericidal rate and logarithm value of killing Escherichia coli quantitatively

表5 定量杀灭金黄色葡萄球菌的杀菌率及杀灭对数值Table 5 Bactericidal rate and logarithm value of killing Staphylococcus aureus quantitatively

2.4 使用液稳定性试验 复方癸甲氯铵溶液在使用浓度下，在第0～3天随时间的延长pH有下降趋势，但消毒效果稳定，可满足杀菌要求,见表6、表7。

表6 使用液稳定性试验平均杀菌率结果Table 6 Average sterilization rate results of the working liquid stability test (%)

表7 使用液稳定性试验pH结果Table 7 pH results of the working liquid stability test

2.5 金属腐蚀性试验 复方癸甲氯铵溶液对金属腐蚀性的测定试验结果见表8。复方癸甲氯铵溶液原液稀释50倍后，在72 h时测定碳钢、铜、铝和不锈钢的腐蚀速率分别为0.077 9、0.012 7、0.000 6 mm/a和0.001 5 mm/a。结果表明复方癸甲氯铵溶液对不锈钢和铝基本无腐蚀性，对碳钢和铜有轻度腐蚀性。

表8 金属腐蚀性试验结果Table 8 Metal corrosion test results

3 讨论

近年来动物传染病已经严重影响了畜牧业发展，一些重大动物疫病不仅给我国畜牧业造成了巨大经济损失，甚至会危及人类的生命安全。因此在现代养殖业中建立有效的消毒防疫体系至关重要[10]。为了控制疾病、获取最佳效益，养殖企业需要制定合理的消毒方案[11]。

本试验制备的复方癸甲氯铵溶液由苯扎氯铵和癸甲氯铵复方组成，苯扎氯铵和癸甲氯铵分别是常见的单、双链季铵盐类阳离子表面活性剂，具有良好的杀菌效果。研究发现，一种季铵盐通过与其他不同季铵盐混合或复配有利于提高杀菌效果[12]。针对这种特性，本试验分别采用悬液定性杀菌试验和悬液定量杀菌试验对复方癸甲氯铵溶液的消毒杀菌效果进行评价，结果显示该消毒剂对革兰阴性和革兰阳性代表菌均具有很好的杀菌活性，在较低浓度条件下即能够快速杀灭细菌；同时，较对照消毒剂癸甲溴铵溶液，复方癸甲氯铵溶液的杀菌效果更好。研究证明，将2种或2种以上阳离子表面活性剂进行合理配伍，可克服单方使用的限制条件，提高杀菌效果，且性能稳定[13]。本试验通过使用液稳定性试验证明，复方癸甲氯铵溶液在使用浓度下放置0～3 d，pH有下降趋势，但消毒效果稳定，可满足杀菌要求；通过金属腐蚀性试验证明，该溶液对不锈钢和铝无腐蚀性，对碳钢和铜有轻度腐蚀性。本试验结果表明，复方癸甲氯铵溶液具有良好的杀菌效果且使用性能稳定，为该溶液的实际应用提供数据支持。