东风螺、弯竹蛏和斑节对虾的壳基质蛋白组学分析

张爱华，卫子嫣，姚宇阗，张道锋，黄建科，刘 闯*

（1.河海大学 海洋学院海洋生物技术与生物资源利用研究所,江苏 南京 210098；2.江苏省沿海开发集团有限公司,江苏 南京 210000）

碳酸钙是无脊椎动物外骨骼的主要成分，在海洋生物中尤为常见[1]。例如，软体动物壳由碳酸钙和不同比例的有机成分（主要是蛋白质、酸性多糖和甲壳素）组成[2]，这些结合起来，赋予每种软体动物的外壳独特的物理和化学性质[3]。尽管外壳中蛋白质的含量少于5%，但它们在生物矿化中起着重要作用，这些蛋白可以控制碳酸钙晶体的成核、生长、晶型[4]，被称为壳基质蛋白（Shell Matrix Proteins,SMPs）[5]。

不同生物体中存在不同的壳基质蛋白表明它们可能具有不同的生物学功能[6]。例如，在中医中，牡蛎壳粉常被用作药物[7]。近年来使用扇贝壳粉进行活性研究显示，它们具有良好的抑制病毒的能力，扇贝壳粉能在5 s 内灭活禽流感病毒，在5 s 内灭活新城鸡疫病毒，在30 s 内灭活鹅细小病毒[7]。贝壳粉的生物医学效应是由不同种类的SMPs 而产生[8]，因此，有必要研究不同物种，特别是不同动物门之间SMPs 的差异，而这种差异性也可为未来的物种鉴定和保护、资源开发利用提供辅助参考。

本文选择中国沿海3 种不同的海洋动物作为研究对象，分别为双壳纲的弯竹蛏、腹足纲的东风螺和甲壳纲的斑节对虾。目前这3 种生物的壳基质蛋白均未被报道，限制了我们对其潜在功能的理解，也不利于我们对其进行资源的开发利用。文章以这些具有经济价值的海洋生物为研究对象，利用蛋白质组学的方法探索它们壳基质蛋白的差异性以及对碳酸钙晶体生长的影响，为利用它们自身的壳基质蛋白特异性进行渔业方面的应用，例如加快其生长周期，提升其生长尺寸等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本文研究弯竹蛏采集于江苏省南通市，体长约为5 cm；东风螺和斑节对虾均采集于南中国海，体长分别约为2 cm 和13 cm。3 种实验样品的形态见图1，其种属树状结构见图2。

图1 3 种海洋贝类实验样品形态Fig.1 Shapes of the three marine shellfish used for experimental specimens

图2 3 种样品的种属树状图Fig.2 A simplified species dendrogram of the three species

弯竹蛏（Solen arcuatus）属于双壳纲竹蛏科的竹蛏属[9]，壳小而细长，薄且易碎，壳体前端和后端略微向上弯曲，后缘中部和腹部边缘都略微凹陷；东风螺（Babylonia areolates）属于软体动物腹足纲蛾螺科东风螺属[10]，其生活习惯为白天潜伏在沙土中，露出水管，吸食经过的浮游动物，晚上借助自身分泌的黏液滑动爬行到处寻找食物，一般分布于中国东南部沿海，以及东南亚和日本海域；斑节对虾（Penaeus monodon）属于对虾科对虾属，是对虾属中最大的个体[11]，与其他对虾相比，其表面光滑、壳稍厚[12]，由于体型、栖息地、食物和其他因素的不同，体色也会有所不同，斑节对虾成虾喜欢栖息在泥泞或沙质海底，它们分布在水深约60 m 的浅海中，是常见的海鲜食品。

1.2 蛋白质提取与质谱分析

从壳中提取出壳基质蛋白流程为：①为了粉碎3 种样品的外壳，需将外壳与肌肉组织分离，并将分离后的外壳分别在质量分数5% NaOH 中浸泡24 h，用去离子水洗涤、干燥；②放入粉碎机中粉碎成粉，添加0.8 mol/L EDTA 溶液（pH=8.0）和30 μL AEBSF 试剂于装有样品粉末的烧杯中，并将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌50 h；③再将搅拌后的样品粉末溶液放置在4 ℃冰箱中过夜，静置使固体沉淀；④取出上清液，转移到离心管中进行4 000 r/min 离心10 min；⑤将上清液移入截流量为3 kDa 的透析袋，并将密封后透析袋放入含有1 000 mL 去离子水的烧杯中，置于4 ℃冰箱，早晚更换烧杯中的去离子水，用去离子水多次冲洗样品的不溶部分；⑥将10 mmol/L 二硫苏糖醇（C4H10O2S2）、1%十二烷基硫酸钠（C12H25SO4Na）添加到含有0.3 mmol/L-Tris 的HCl 溶液（pH=8）中并转移至离心管，100 ℃水浴加热30 min，每5 min 摇动一次离心管，使溶液与样品充分接触[13]。

为进一步浓缩提取出壳基质蛋白，首先需先在室温下冷却样品；其次，将含有蛋白质的溶液样品4 000 r/min离心10 min，置部分部分上清液于截流量为3 kDa 透析袋中，密封；再次，将透析袋放入含有1 000 mL 去离子水的烧杯中，4 ℃储存2 d（每8 h 更换1 次水）；从次，将透析后的可溶性和蛋白质部分转移到带有截流量为3 kDa 半透膜的离心管中进行4 000 r/min 离心30 min，用于浓缩蛋白；最后，浓缩后的壳基质蛋白转移至小型离心管中，并在-80 ℃下储存以备SDS-PAGE 凝胶电泳检测有无蛋白质存在，60 min 电泳后，取出胶板，切割电泳条带并通过LC-MS/MS 对得到的蛋白质序列片段进行分析，确定壳基质蛋白的种类与功能。

1.3 蛋白质鉴定与分析

根据Liu 等[13]制定LC/MS-MS 实验方法方案，本研究使用LTQ Orbitrap Velos 质谱仪（赛默飞世尔，美国）和Dionex U-3000 快速分离纳米LC 系统（戴安Thermo Scientific，美国）进行蛋白质的肽段分离，并通过Uniprot蛋白数据库对提取的壳基质蛋白进行分析。液相色谱的流动相A、B 的参数如下：流动相A 中的组分为0.1%甲酸（CH2O2），流动相B 的组分为0.1%甲酸和80%乙腈（C2H3N）。具体流动相参数见表1。

表1 流动相参数Table 1 Flow phase parameters

1.3.1 蛋白质提取

首先，将已提取出的壳基质蛋白溶液，加入4 倍体积的丙酮裂解液中，-20 ℃过夜；其次，放入离心机，17 000 r/min、4 ℃离心15 min，取出沉淀，挥干后备用；再次，在1 mL 预冷的RIPA 中加入5 μL 磷酸酶抑制剂、1 μL 蛋白酶抑制剂和10 μL AEBSF 混匀配制裂解液，冰上保存数分钟；从此，将样品加入200 μL 裂解液中，冰敷后用超声破碎仪处理；最后，超声后12 000 r/min、4 ℃离心20 min，吸出上清液，用BCA 检测试剂盒进行定量。

1.3.2 蛋白质酶切

蛋白质酶切的具体步骤为：①取定量后50 μg 蛋白液，加入DTT 试剂使其终浓度为50 mmol/L，37 ℃反应1 h；②随后加入IAA 试剂使其终浓度为100 mmol/L，室温避光反应40 min；③将还原烷基化后的蛋白溶液加入10 kDa 的超滤管中，12 000 r/min 离心20 min，舍弃收集管的底部溶液；④加入8 mol/L 尿素（pH=8.5）100 μL，12 000 r/min 离心20 min，舍弃收集管的底部溶液，重复2 次离心；⑤加入25 mmol/L 碳酸氢铵溶液100 μL，12 000 r/min 离心20 min，舍弃收集管的底部溶液，重复3 次离心，再次更换新收集管，在超滤管中加入25 mmol/L碳酸氢铵溶液（含胰蛋白酶）始终体积为50 μL，胰蛋白酶与蛋白的质量比为1∶50，37 ℃反应过夜；⑥次日先加入胰蛋白酶（胰蛋白酶与蛋白质量比1∶100），37 °C 反应4 h，反应后12 000 r/min 离心20 min，酶解后的肽段溶液离心于收集管底部；⑦在超滤管中加入50 μL 25 mmol/L 碳酸氢铵溶液，12 000 r/min 再次离心20 min，与第⑥步得到的肽段溶液合并，收集管底部共得到100 μL 酶解后的样品；⑧向多肽样品中加100 μL 0.2%TFA溶液，混匀，C18 小柱用乙腈稳定后，加入1 mL 0.1%TFA 溶液冲洗2 次，把多肽样品转移到C18 小柱，用500 μL 0.1%TFA 洗脱，并用500 μL 70%的乙腈溶液洗脱；⑨收集多肽样品液体，真空干燥。

1.3.3 反相液质联用RPLC-MS

将收集后的肽段用20 μL 溶解液（0.1%甲酸、5%乙腈）溶解，充分振荡涡旋，13 500 r/min、4 ℃离心20 min，上清转移到上样管中，吸取8 μL 进行质谱鉴定。

1.3.4 质谱参数

分离后的肽段直接进入Thermo Scientific Q Exactive PLUS 质谱仪进行在线检测，具体参数见表2。

表2 质谱设置参数Table 2 Parameters set up for the Mass spectrometry

1.3.5 数据库检索

本实验运用Maxquant Version 1.6.17.0 软件进行数据库检索，获得3 种样品中提取的蛋白质肽段序列信息，具体检索参数见表3。

表3 Maxquant 软件鉴定参数Table 3 Identification parameters for Maxquant software

1.4 碳酸钙结晶实验和扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）

使用BCA 检测试剂盒测定蛋白质浓度后，在含有5 g 固体碳酸铵的干燥器中进行碳酸钙结晶实验。首先，将CO2缓慢扩散到6 个细胞培养皿（Nest，无锡，中国）；其次，将培养皿置于密闭干燥器中室温下10 h，其中每个培养皿中含有1 个滴加180 μL 20 mmol/L CaCl2和20 μL 蛋白质的盖玻片，蛋白质浓度梯度为50、100 和200 μg/mL，在放置盖玻片时，用去离子水替换蛋白质作为对照组；最后，经过10 h 的结晶实验，将含有碳酸钙晶体样品的盖玻片用水冲洗2 次并风干。将风干后的含有碳酸钙晶体样品的盖玻片通过溅射法制备的纳米金薄膜后，运用扫描电子显微镜（SEM,FEI Quanta 200,15 kV）检查晶体的形态。

2 结果与讨论

3 种实验样品外壳基质蛋白的SDS-PAGE 显示斑节对虾SMPs 分子量约为70 kDa，而东风螺SMPs 和弯竹蛏SMPs 分子量分布在整个凝胶中（图3）。LCMS/MS 分析结果（表4、表5 和表6）发现：斑节对虾、东风螺和弯竹蛏中分别有22、8 和8 种SMPs（图4）。通过Uniprot 蛋白数据库对SMPs 进行分析，将其分为不同的类别，如生物矿化蛋白、免疫相关蛋白、胞内蛋白以及功能未知的蛋白[5]，并通过Venn 图分析斑节对虾、东风螺和弯竹蛏之间蛋白质的相似性和差异性（图4）。结果表明，3 种实验样品都含有血蓝蛋白，同时，在斑节对虾和东风螺中还发现一些未经鉴定的蛋白质，这些蛋白质有待进一步分析。

图3 3 个样品的蛋白胶图Fig.3 A SDS-PAGE picture of the three species

图4 来自 3 种物种的基质蛋白种类Fig.4 Shell matrix proteins from the three species

表4 东风螺中提取并鉴定的壳基质蛋白种类以及质谱结果Table 4 The SMPs extracted and identified in Babylonia areolates and their LC-MS/MS results

表6 弯竹蛏中提取并鉴定的壳基质蛋白种类以及质谱结果Table 6 The SMPs extracted and identified in Solen arcuatus and their LC-MS/MS results

2.1 3 种物种共有蛋白：血蓝蛋白

软体动物（腹足纲和双壳纲）和节肢动物（虾、蟹）的血液中含有血蓝蛋白[14]，是一种呼吸蛋白，在节肢动物和软体动物的血淋巴中因含有Cu2+而使血蓝蛋白呈现蓝色。血蓝蛋白在脱氧状态下是无色的，在结合氧的状态下呈现出蓝色，其主要生物学功能与体内的氧气输送有关[15]。血蓝蛋白也是一种多功能蛋白，与生物体内能量储存、渗透压维持和蜕皮过程的调节有关[15]，此外，它还具有酚氧化酶活性以及抗菌功能。小龙虾的血蓝蛋白被用于通过浸渍涂层进一步修饰几丁质支架，从而起到增加初始细胞黏附、增强增殖和成骨分化的作用[14]。在本文的实验中，甲壳纲、腹足纲和双壳纲动物的样品中都检测出血蓝蛋白，且最新研究在乌贼内贝壳中也发现了这种蛋白质[13]，表明血蓝蛋白在生物矿化中可能起着某种重要作用。

2.2 双壳纲和甲壳纲共有蛋白：微管蛋白

微管蛋白由2 种密切相关的55 kDa 蛋白质的二聚体组成，称为α-和β-微管蛋白。这2 种蛋白质的序列在真核生物界高度保守，由相对独立的基因或小基因家族编码；α-和β-微管蛋白聚合形成微管，微管是真核细胞骨架的主要组成部分，为真核细胞提供结构和形状的支撑作用[16]。微管蛋白也存在于各种生物矿物的壳基质中[16]，本研究在斑节对虾和弯竹蛏中发现的微管蛋白可能与其他研究中发现的微管蛋白具有相同的功能，即可以支撑细胞的结构。但微管蛋白在生物矿化过程中的生物学功能仍有待进一步研究。

2.3 大量的未表征蛋白

地球上物种数量众多，它们体内的蛋白质种类繁多，每个序列的细微差异都会影响其生物学功能[17]。尽管测序技术发展迅速，但仍有大量功能尚不清楚的蛋白质需要鉴定，这些蛋白质被称为未表征蛋白[18]。因此，识别这些蛋白质的开放阅读框架是一项重要的研究任务。本文在3 种物种样品的壳基质中发现了许多未经鉴定的蛋白质，尤其是在斑节对虾中，它们的生物学功能需要在未来的实验中进一步分析和研究。

2.4 双壳纲特征蛋白：N66 基质蛋白

在从弯竹蛏提取的SMPs 中，发现了N66 壳基质蛋白，该蛋白被Tan 等[19]于2019 年首次报道具有碳酸酐酶活性，并能在体外形成多晶型的碳酸钙晶体。研究发现，与天然N66 蛋白相比，重组N66 蛋白具有更高的碳酸酐酶活性，并能在体外产生更大尺寸的晶体，并且可能通过糖基化和/或磷酸化调节其活性[20]。RIVERAPEREZ 等[9]研究表明，N66 壳基质蛋白在软体动物外壳中扮演着钙化调节者的角色，它们可作为钙“浓缩器”，其碳酸酐酶的功能可产生碳酸盐离子，这些离子在矿化点组装成CaCO3，并且对钙棱柱层和文石珍珠层中的贝壳形成都具有重要作用[9]。本文研究的3 种物种的样品中，N66 壳基质蛋白只在弯竹蛏中被检测出来。根据文献报道[20]，N66 壳基质蛋白在翼珍珠贝和珠母贝中也有发现，同弯竹蛏一样，这3 种生物均来自双壳纲。这一现象表明N66 壳基质蛋白可能主要存在于双壳纲中，可作为特征蛋白用于未知来源贝壳的鉴定。

2.5 矿化蛋白

从东风螺、弯竹蛏和斑节对虾外壳中提取的SMPs 中还发现了矿化蛋白，这些矿化蛋白在生物矿化过程中起到了至关重要的作用。东风螺壳SMPs 中的一种非特征蛋白具有生物矿化作用，进一步分析其结构域发现，几丁质结合域出现在位点25～80、92～153 和176～225，这一蛋白的蛋白序列长度为243 aa（图5）。在弯竹蛏的SMPs 中存在一段长568 aa 的矿化蛋白，其位点59～564 存在碳酸酐酶的合成区域。碳酸酐酶是含有金属锌的一种酶，其可以催化二氧化碳为碳酸根离子，进一步合成碳酸氢盐。经过结构域分析发现，斑节对虾SMPs 的一种非特征蛋白可能具有类似的生物矿化作用，在一段长度为95 aa 的序列中，其位点20～66 出现与几丁质结合有关的结合域。另外，斑节对虾SMPs 中还存在其他几种矿化蛋白，例如角质层蛋白AM1199、CP14.6 和CP575，其结构域中均存在几丁质结合位点，并且在角质层蛋白AM1199 和CP14.6 的结构域中，在几丁质结合位点之后还存在一段低复杂度的蛋白序列。角质层蛋白AM1199 的低复杂度序列出现在位点6～15，其中丙氨酸量较多，另一段低复杂度序列出现在位点97～124，其中脯氨酸含量较多；而角质层蛋白CP14.6 的低复杂度序列出现在位点150～164，显示丙氨酸含量较多。

图5 3 种物种样品SMPs 中与矿化作用有关的蛋白Fig.5 Proteins related to the mineralization in the SMPs of the three species

2.6 甲壳纲特征蛋白：虾壳蛋白

从斑节对虾背壳提取的SMPs 与东风螺、弯竹蛏的SMPs 对比研究发现，斑节对虾的SMPs 种类更丰富多样，并存在一些特有的蛋白质，如斑节对虾SMPs 中的精氨酸激酶，这种蛋白质在本文所研究的软体动物中不存在，可能在节肢动物中普遍表达，具有一定的特异性。精氨酸激酶是一种高度保守的磷酸源激酶，一种在无脊椎动物中发现的ATP 磷酸转移酶，对精氨酸残基进行磷酸化修饰，一般含于产生尿素的动物的肝脏、肾脏、精巢中，作为尿素循环的一个环节起作用，该酶蛋白通常存在于具有潜在能量代谢功能的贝壳中[21]。

在斑节对虾的SMPs 中也发现了几种角质层蛋白，它们通常与几丁质结合，参与节肢动物表皮的形成。其中在1999 年Andersen[22]对蟹壳的SMPs 的研究中发现AM1199；Rebers 等[23]在蛹和成虫的表皮柔性节间区域发现角质层蛋白CP14.6。AM1199 和CP14.6 存在于斑节对虾的SMPs 中，表明斑节对虾外壳的形成涉及角质层蛋白发挥其独特的生物学功能。

2.7 壳基质蛋白对碳酸钙晶体形成的影响

扫描电镜结果（图6）表明，从3 种物种样品中提取出的SMPs 对碳酸钙结晶有重要影响，且SMPs 浓度越高，结晶作用越明显，表明提取的SMPs 中至少含有1 种与结晶有关的蛋白质参与了结晶的形成过程。例如，从斑节对虾中提取的SMPs 在其浓度为50 μg/mL 时，对碳酸钙结晶的影响不明显（图6a）；当浓度为100 μg/mL时，效果开始显现（图6b），晶体边缘的棱角逐渐趋于圆润光滑，晶体形态存在向球体转变的趋势；在浓度为200 μg/mL 时，晶体的形状发生变化，并在晶体表面出现尖状的凸起（图6c）。弯竹蛏的壳SMPs 的结晶实验结果与斑节对虾的情况类似，不同的是晶体在SMPs 浓度100 μg/mL（图6e）和200 μg/mL（图6f）分别呈现球形和椭圆形。

图6 不同SMPs 浓度对碳酸钙结晶形成影响的扫描电镜图Fig.6 SEM pictures showing the influence of different SMPs concentrations of on CaCO3 crystallization formation

3 结语

弯竹蛏、东风螺和斑节对虾的壳基质蛋白在已有的生物矿化研究中是缺少的，本研究通过扫描电镜以及LC-MS/MS 和生物信息学等现代技术手段对3 种物种的壳基质蛋白进行蛋白质组学分析，发现血蓝蛋白作为壳基质蛋白是3 种海洋生物所共有的。N66 蛋白可能仅存在于软体动物双壳纲中，说明不同海洋生物壳基质蛋白存在差异性。N66 蛋白质具有物种特异性，在未来的物种鉴定、水产养殖和海岸生物资源的开发中可能具有重要的参考意义。本研究结果有助于探索不同物种间壳基质蛋白的差异性和多样性，从而为沿海物种的资源利用提供一定基础。