洗脱剂极性对沉积物长链烯酮硅胶柱层析效果的影响

2022-09-28陈国生孔德明邱梓惠冯伟家杨嘉雯

广东海洋大学学报 2022年5期

陈国生，孔德明,2,3，邱梓惠，冯伟家，杨嘉雯

（1.广东海洋大学海洋与气象学院，广东湛江 524088；2.陆架及深远海气候、资源与环境广东省高等学校重点实验室，广东湛江 524088；3.广东海洋大学深圳研究院，广东深圳 518108）

长链烯酮是一类产生于颗石藻的生物标志物，其碳数在37～39 并含有2～3 个碳碳双键[1-2]。其中，研究最多的是碳数为37（C37）的长链烯酮，其不饱和度指标=C37:2/ (C37:3+C37:2)被作为一种重建古海表温度（SST）的指标[3-4]。用于计算的C37:3和C37:2烯酮分子差异仅在于烃链上的一个碳碳双键，其分子性质稳定且差异很小，在海洋环境中迁移、埋藏过程中不容易发生差异化降解，因此被广泛应用于SST重建[5-8]。

为准确测定长链烯酮分子含量，需从沉积物提取有机质并进行硅胶柱层析，以得到杂质较少的含烯酮组分。目前不同实验室对柱层析的洗脱剂的选择有所差异。白亚之等[9]和李松等[10]使用的洗脱剂正己烷（H）和二氯甲烷（D）体积比分别为1∶2和1∶1以得到含烯酮组分；张静静等[11]使用VH∶VD=2∶8 的洗脱剂分离南海表层沉积物的长链烯酮；Kong等[12]则使用纯D 作洗脱剂分离长链烯酮。柱层析过程可能对烯酮含量准确测定产生影响的有2个主要因素，一是烯酮能否被完全洗脱，二是否有杂质分子干扰烯酮分子色谱峰。如果洗脱剂的极性过小，会导致烯酮不能被完全洗脱；而过大则会引入诸如酯类或醚类分子干扰烯酮色谱峰，均可能增加重建SST 的误差。因此，有必要研究不同极性洗脱剂对C37和C38烯酮分子的分离效果，评估不完全洗脱对的影响，并探寻适宜配比的洗脱剂以保证长链烯酮可被恰好完全洗脱。本研究以不同比例H和D混合组成洗脱剂，分析其对C37和C38烯酮的硅胶柱层析分离效果，探讨长链烯酮分子间的极性差异和不完全洗脱对指标的影响，以期得到适宜长链烯酮的洗脱剂配比。

1 材料与方法

1.1 样品来源

本实验的沉积物样品是2016 年广东海洋地质调查局南海航次采集的南海北部深海（112.479°E，15.442 °N，水深1 985 m）表层沉积物，为青灰色黏土质，在预实验中测得样品的长链烯酮含量高、可重复性强，适合用于本实验。

1.2 实验材料与器材

试剂为二氯甲烷（D）、正己烷（H）、甲醇（M）、甲苯（T），均来自ANPEL 公司（上海），纯度级别均为农残级（GC residue analysis）、孔径63～210 μm 的硅胶来自Sigma公司（美国）。

器材为5.5 mm 玻璃滴管、4 mL 细胞瓶、不同容量的试剂瓶等玻璃器皿，使用前需450 ℃灼烧；硅胶色谱小柱固定架、Angilent-7890B气相色谱仪等。

1.3 制备硅胶层析柱

根据需要选取适量孔径63～210 μm 的硅胶，配制体积比为93∶7 的D-M 混合溶液对硅胶进行索氏抽提，约72 h 后取下烘干，量取1.5 mL 抽提后的硅胶填装于450 ℃灼烧后5.5 mm 玻璃滴管中，将装制好的硅胶色小柱置于110 ℃烘箱中活化8 h以上，去除硅胶表面因氢键所吸附的水分，恢复硅胶的极性（硅醇基的吸附力）。

1.4 样品前处理

将沉积物冷冻干燥后捣碎混合均匀，称取约5 g样品于60 mL 玻璃管中，按固液质量（g）体积（mL）比1∶2 的比例加入体积比为9∶1 的D-M 混合溶液，超声破碎抽提30 min，重复3 遍；获得的抽提液在氮气环境下吹干后加入60 g/L 的KOH 甲醇溶液皂化8 h 以上，然后加50 g/L 的NaCl 溶液混合，加H 振荡，收集上清液，重复4遍。

1.5 不同极性配比洗脱剂的选择

纯H 无法洗脱长链烯酮，而纯D 在洗脱长链烯酮的同时，部分干扰杂质也一起被洗脱，由此推测长链烯酮系列分子的极性介于H 和D 之间。因此，本实验设置体积比从18∶1 到1∶2 的H-D 作为洗脱剂进行样品洗脱。将前处理得到的萃取物转移进硅胶柱，依次加入约4 mL 以极性递增的配比洗脱剂顺序进行洗脱，同时，另取前处理的样品先后加入4 mL T和D洗脱。

1.6 样品检测

本实验样品检测使用Angilent 7890B 气相色谱仪，色谱柱为DB-1 毛细管色谱柱，Agilent 122-1062（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；氢气作为载气。自动进样器注入样品2 μL；升温程序为60 ℃维持1 min，以20 ℃/min 的速率升至270 ℃，以10 ℃/min 升至300 ℃，以5 ℃/min 升至310 ℃，最后由氢焰离子检测器（FID）进行检测。

2 结果与分析

本实验选取南海表层沉积物作为标准样品，检测出的长链烯酮为C37和C38，C37分为甲基（Me）的C37:3和C37:2两类，C38则为甲基（Me）和乙基（Et）的C38:3和C38:2四类，其中，C37:2、C38:2Et 和C38:2Me 含量高，而C37:3、C38:3Me 和C38:3Et含量较低（图1）。这是由于南海地处热带与亚热带，海表常年高温，因而颗石藻更偏好合成不饱和键较少的长链烯酮。样品色谱峰基线平稳，无杂质峰干扰目标烯酮峰，是良好的标准样品。本实验的长链烯酮结构式见图2。

图1 沉积物所含长链烯酮色谱峰Fig.1 Chromatographic peaks of long-chain alkenones in sediments

图2 C37和C38烯酮分子结构式Fig.2 Structural formulas of C37 and C38 alkenones

2.1 不同极性洗脱剂的分离效果比较

本实验使用T 和D 对标准样品进行淋洗，发现C38:2Et 和C38:3Et 在T 中被完全洗脱，而C37:3、C37:2、C38:2Me 和C38:3Me 在T 和D 两种洗脱剂分离的样品中（图3）。为进一步研究烯酮分子的分离效果，本实验改变H 与D 体积比从18∶1 到1∶2，使洗脱剂极性逐渐增大，对标准样品的长链烯酮进行洗脱。测定的色谱峰结果见图4。使用VH∶VD为18∶1～9∶1的洗脱组分中均无发现长链烯酮。VH∶VD为8∶1 时洗脱组分中检测到较小的C38:2Et 色谱峰，到VH∶VD为7∶1 时峰面积明显增大。至VH∶VD为6∶1 时，洗脱组分中开始检测到微量的C38:3Me，至VH∶VD为5∶1时，洗脱物中检测到较小的C37:2、C38:2Me 和C38:3Et色谱以及较大的C38:2Et色谱峰。至VH∶VD为4∶1时，洗脱物色谱峰中依次出现C37:2、C38:3Et、C38:3Me、C38:2Et、C38:2Me，且峰面积比之前组分显著更大。至VH∶VD为3∶1洗脱物中，出现少量的C37:3，而C38:2Et明显减少；到VH∶VD为2∶1的洗脱物中，不再出现C38:2Et色谱峰，说明C38:2Et在VH∶VD为3∶1时已被完全洗脱。VH∶VD为2∶1与1∶1 的洗脱物中，均有C37:3、C37:2、C38:2Me 和C38:3Et；在VH∶VD为1∶2 的洗脱物中，两个平行样品的基线都十分平稳，无任何长链烯酮色谱峰出现。

图3 T和D作洗脱剂的烯酮色谱Fig.3 Chromatograms of the separation of alkenones by Toluene and Dichloromethane

图4 不同体积比的H-D洗脱剂对烯酮的分离色谱Fig.4 Chromatograms of the separation of alkenones by H-D eluent at different volume ratios

由此可知，VH∶VD为18∶1～9∶1的洗脱剂无法从硅胶层析柱中洗脱长链烯酮分子，当VH∶VD为8∶1到1∶1，烯酮陆续开始被洗脱出。其中，C38:2Et 最先被洗脱，出现在VH∶VD为8∶1到3∶1的洗脱物中；其次为C38:3Me 出现在VH∶VD为6∶1～1∶1 的洗脱物中；C37:3为最难被洗脱的烯酮分子，其在VH∶VD为3∶1～1∶1的洗脱物被检出。当洗脱剂VH∶VD小于3∶1，所有烯酮分子均可被洗脱出，但并不能被完全洗脱，直至VH∶VD为1∶2，不再出现烯酮分子被洗脱，表明洗脱完全。因此，根据本实验的样品用量以及洗脱效果看来，选择洗脱剂H 和D 配比范围适宜在3∶1～1∶2，小于1∶2则可完全将所有烯酮分子洗脱。

表1 和表2 分别给出2 个平行样品依次被不同洗脱剂所洗脱的各烯酮分子色谱峰面积。由于各烯酮分子含量和峰面积具有较大差别，本实验以每种烯酮分子的所有洗脱组分的峰面积作为总量，然后计算各洗脱组分其峰面积占总量的百分比（图5），进而更清晰看出各烯酮分子被洗脱的效果。图5显示2 个平行样品的各烯酮分子被洗脱规律高度相似。C38:2Et 最大占比出现在4∶1 的洗脱组分中，约占总量的37%～44%；C38:3Et 最大洗脱量出现在3∶1 组分，约占总量的40%～44%；C37:2和C38:2Me 最大洗脱量均在2∶1 组分，其中C37:2约占总量的42%～53%，C38:2Me 约占总量的44%～54%；C37:3最大洗脱量组分为1∶1，约占总量的44%～64%。而C38:3Me的洗脱效果较为特殊，在VH∶VD从6∶1 降低到2∶1 的各洗脱组分，其峰面积增加缓慢，并在VH∶VD为2∶1和1∶1 的洗脱组分中达到最大面积，但与其他洗脱组分差异并不如其他烯酮分子大。总的看来，C37:3、C37:2、C38:2Me、C38:3Et 和C38:2Et 的峰面积随着D 在洗脱剂中的占比增加而迅速增大，表明相同体积的洗脱液，极性越大而洗脱能力越高。

图5 各洗脱组分中烯酮分子的峰面积比例Fig.5 Proportion of peak area of alkenones in each elution component

表1 平行样品3不同洗脱剂配比对应的各烯酮分子的峰面积Table 1 The peak area of different alkenones corresponding to different volume ratios of sample 3

表2 平行样品4不同洗脱剂配比对应的各烯酮分子的峰面积Table 2 The peak area of different alkenones corresponding to different volume ratios of sample 4

在柱层析分离过程中，C37和C38烯酮的分离会受到C36和C37烯酸酯等杂质共洗脱的影响[13]。Zheng 等[14]选用不同型号的色谱柱分开长链烯酮和长链烯酸酯，成功发现型号为Rtx-200 (105 m ×250 μm ×0.25 μm)GC 色谱柱能成功消除二类物质间的共洗脱，甚至能分开烯酮间的共洗脱；Wang等[15]利用AgTCM 柱分离，也能很好将长链烯酮和长链烯酸酯及系列杂质分开。但在烯酮组分中C36和C37烯酸酯通常不到C37长链烯酮的10%[16]，通过皂化反应也可去掉大部分烯酸酯和蜡酯。而对于皂化无法去除的其他杂质，可能是导致不同实验和不同处理方法长链烯酮重建温度重现性较差的原因[17]。因此，探索洗脱剂对长链烯酮的分离效果，选择适合极性的洗脱剂可能是提高重现性途径之一。本实验发现从VH∶VD=8∶1 时开始有烯酮分子被洗脱，在VH∶VD=3∶1 时所有C37和C38烯酮分子均可被洗脱，最终在VH∶VD=1∶2 时（图4），既能洗脱C37和C38长链烯酮，又不使太多杂质分子进入烯酮组分。本实验平行样品3 和4 的值分别为0.933 和0.936，用南海经验公式换算得到的SST 分别为27.13 ℃和27.25 ℃，重现性较好。对同一批样品持续一年的前处理和检测，重建SST的偏差均在0.5 ℃内。

2.2 长链烯酮系列分子的极性比较

长链烯酮的各分子极性存在微小差异，随着洗脱剂极性逐渐增强，各烯酮分子被洗脱的顺序会有所差别（图5），其极性大小为C38:2Et＜C38:3Me＜(C38:3Et、C38:2Me和C37:2)＜C37:3。但从洗脱比例峰值来看，其极性大小顺序为C38:2Et＜C38:3Et、(C38:2Me、C37:2)＜(C38:3Me、C37:3)。两个平行样品的结果显示，C38:2Me 和C37:2在不同配比洗脱剂中的洗出比例非常接近，表明这两个甲基酮分子极性非常接近。从分子结构看（图2），长链烯酮主要由甲基或乙基酮与链长为35 或36 的不饱和烃基构成，由于羰基是强极性基团，甲基酮的极性大于乙基酮，极性大小应该为(C38:2Et、C38:3Et)＜(C38:2Me、C38:3Me、C37:2和C37:3)。这与根据洗脱峰值判断的结果一致。可见，推断根据洗脱峰值对应的洗脱剂极性来判断烯酮分子极性的顺序更为合理，极性大小顺序为C38:2Et＜C38:3Et＜(C38:2Me、C37:2)＜C37:3。

2.3 洗脱效果对指标温度的影响

=C37:2/ (C37:2+C37:3)，因此，C37:2和C37:3的洗脱效果将会影响和重建的温度值。假设使用VH∶VD=3∶1 的洗脱剂，其洗脱的的C37烯酮量应为该洗脱组分与其前面各组分的累加（表3）。根据两个平行样品累加的C37:2和C37:3峰面积计算的分别为0.967和0.981，SST值分别为28.23 ℃和28.70 ℃；同理，VH∶VD=2∶1 时计算的分别为0.956 和0.967，SST 分别为27.87 ℃和28.24 ℃。上述情况中，VH∶VD=3∶1 和2∶1 时均未完全洗脱，而VH∶VD=1∶1 时完全洗脱得到的换算SST 为27.13 ℃和27.25 ℃，呈逐渐下降趋势。这说明在未完全洗脱的情况下，或导致的重建温度偏高，原因可能是由于C37:2的极性小于C37:3，未完全洗脱时，其洗脱的比例高于C37:3，导致换算的SST 偏高。因此，硅胶层析分离长链烯酮时，如果未完全洗脱会导致值偏大，从而使重建的SST高于真实值。