胶州湾地区贝类的全氟辛酸健康风险评价

于永兴，李风铃,姚琳，郭萌萌，江艳华，耿倩倩，曲梦，谭志军，李兆新，张晓娜

1.中国海洋大学海洋生命学院，青岛 266000

2.农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛 266071

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)，是一种含有8个碳原子烷基链为基本支架的全氟化合物[1]。PFOA具有较强的疏水、疏油和抗高温等优势，是不粘锅、餐具和包装纸等多种食品接触材料生产过程中的一种重要加工助剂[2]。PFOA是一类新型持久性有机污染物(persistent organic pollutants,POPs)，具有POPs的典型特征(持久性、蓄积性、迁移性、高毒性)，对人体具有一定的危害[3]。美国规定2010年排放量减少95%，2015年实现完全淘汰；欧盟规定自2020年7月起不得投放入市场[4]。然而在当前的检测过程中，许多水源、生物体乃至南北极地区都有PFOA检出[5]。

本研究选取的研究对象为双壳贝类。双壳贝类具有独特的生理特性，营底栖生活，滤食浮游生物，相比海洋生态系统中的其他物种更易蓄积水体中的污染物[6]，通过生物放大作用使得污染物随着食物链进入人体[7]。

美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency,US EPA)构建了一个非致癌健康风险评价模型，HR=EDI/RfD，式中：HR为危害系数(hazard ratio)，用以表示风险商值，若该值>1，则表示对人体具有潜在的健康风险；EDI为估计的每日摄入量(estimated daily intake)，即单位体质量的人体预估的每日摄入污染物的剂量(μg·kg-1·d-1)；RfD为参考剂量(reference dose)，即一生的时间之中持续慢性暴露但不产生明显的负面效应的临界剂量[8-10]。生物利用度过程指污染物从口腔开始进入人体，止于血液吸收。它实际上包括了2个主要部分，消化系统的溶解和细胞吸收。前者又可称为生物可给性(bioaccessibility,BA)，是可溶解在消化系统内的最大浓度[11-12]。全氟类化合物主要与生物体内的蛋白质结合，胃作为机体消化蛋白质存在的主要场所，胃消化过程对PFOA在人体的释放起着至关重要的作用[13-14]。因此有必要对贝类中PFOA在胃消化过程的生物可给性进行研究。

胶州湾是以薛家岛(36°00'53″N,120°17'30″E)和团岛(36°02'36″N,120°16'49″E)相连为界的半封闭海湾，一部分与黄海相通，位于山东半岛的南岸。该处海水营养丰富，海水养殖业发达，是重要的海水养殖区[15-16]。青岛是胶东半岛的一个重要海滨城市，作为中国的新一线城市，拥有950万常住人口，150万流动人口，人口数量众多，水产品消费量较大。据统计，菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、紫贻贝(Mytilusedulis)、扇贝(Chlamysfarreri)、牡蛎(Crassostreagigas)和螠蛏(Sinonovaculaconstricta)等是青岛较为重要的贝类品种[17]，在养殖量、市场消费量以及贸易出口等方面均具有重要的地位[18-19]。近年来，水产品质量安全屡出状况，包括贝类产品在内的食品安全一直是消费者关注的问题。因此，有必要针对以上5种经济贝类中的PFOA污染情况进行考察，并开展健康风险评价，以期提出健康食用指导值。

基于以上考虑，本研究围绕胶州湾海域，分别于市南区、市北区、红岛、胶州区、黄岛和薛家岛选取人流量较大、当地居民消费量较高的6个大型农贸市场设置不同取样点。它们分别是新贵都市场、河西农贸市场、红岛海鲜专卖、周家村市场、刘公岛市场和薛家岛爱心市场，以此对典型经济贝类中的PFOA蓄积量进行摸底。同时参考青岛市国民体质测定结果报告[20]划分的年龄段，且在本地区中青年人和老人是水产品摄入的重点人群这一现实情况，将20～60岁中每10岁划为一个年龄段，60岁以上作为一个年龄段，在不同性别消费群体中以调查问卷方式开展膳食调查。随后进行PFOA的生物可给性研究，综合利用以上数据，计算PFOA的健康风险值，为胶州湾地区居民贝类的健康食用提出建议。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 样品采集

在胶州湾海域沿线选择人口较为集中、水产品消费量较大的6个集贸市场设置取样点(图1)。每个取样点采集约30只新鲜贝类(菲律宾蛤仔、紫贻贝、扇贝、牡蛎、螠蛏)，并置于预先盛放海水的水箱中暂存。回实验室后立即解剖，取可食用部分，液氮研磨，并保存于-80 ℃冰箱。6个取样点如图1所示，1号为新贵都市场，2号为河西农贸市场，3号为红岛海鲜专卖，4号为周家村市场，5号为刘公岛市场，6号为薛家岛爱心市场。

图1 取样点示意图Fig. 1 Diagram of sampling points

1.2 贝类样品中PFOA残留量的测定

1.2.1 样品的前处理

各样品于真空冷冻干燥机(CoolSafe 55-9，丹麦Scanvac)中72 h完全冻干。准确称取0.2 g冻干样品于10 mL PP离心管中，每个离心管中加入2 ng内标物MPFOA，然后室温静置12 min。加入4 mL 90%乙腈水溶液，涡旋至完全混匀，超声提取10 min，保证组织中的PFOA彻底释放。8 000 r·min-1离心10 min后，移取1 mL上清液润洗Oasis PRIME HLB固相萃取柱，保持流速为1～2滴·s-1。润洗液流干后，再准确移取2 mL提取液加载至SPE小柱上，保持流速同上，收集流出液。于35 ℃氮气下吹至略低于0.5 mL，该过程大约1 h。用50%甲醇水溶液定容至1 mL，12 000 r·min-1高速离心10 min，将液体收集于闭口上样小瓶中，-80 ℃保存，待测。

1.2.2 液相色谱质谱条件及质控

液相色谱质谱条件参考文献[21]的方法。其中，流动相：A为5 mmol·L-1乙酸铵水溶液，B为甲醇。质谱中PFOA的定性离子对为413/169，定量离子对为413/369。为了防止实验器材对背景值的干扰，实验器材均不选取含有聚四氟乙烯的实验器材，转而使用聚丙烯材质，且于前处理实验前一天预先经过甲醇和超纯水充分冲洗，晾干。样品检测的同时进行空白对照实验，所有实验数据均扣除空白值。以信噪比等于3为界确定检出限。PFOA的标准曲线相关系数为0.99958，曲线的线性范围为0.100～20.0 μg·L-1，样品检出限为0.03 ng·kg-1，加标回收率为97.4%。

1.3 PFOA生物可给性分析

1.3.1 体内消化模拟实验

取2 g样品，置于18 mL离心管中，加水混匀，用1∶1盐酸调节pH=2.0。15 min后，使pH依然保持2.0。每个离心管加入0.1 mL新鲜配制的胃蛋白酶溶液。该溶液由胃蛋白酶0.1 g，加0.1 mol·L-1的盐酸l mL，混匀制得。将离心管置于37 ℃水浴振荡器中，120 r·min-1下振荡2 h，进行胃液模拟消化。

取上述胃消化液至聚丙烯离心管中，放置于4 ℃离心机中，12 000 r·min-1离心30 min。收集上清液。此上清液所含PFOA即为胃液中人可吸收利用的最大PFOA浓度[22-23]。

1.3.2 样品处理

取0.5 mL上述上清液，加入3 mL ddH2O，涡旋1 min，振荡15 min，充分混匀。4 ℃条件下离心30 min，转速为8 500 r·min-1。预先把Oasis HLB(30 μm)的固相萃取柱依次经过3 mL甲醇、3 mL去离子水进行活化。取1.3.1中所得上清液过柱，再用3 mL 10%的甲醇水溶液充分淋洗，弃去。准确吸取3 mL甲醇洗脱目标物，控制流速为1～2滴·s-1。洗脱液涡旋混合，0.2 μm微孔滤膜过滤1 mL至上样小瓶，待测。HPLC-MS条件同1.2.2。

1.3.3 生物可给性(BA)

计算公式为BA(%)=消化液中PFOA的总量(ng)/样品中PFOA的总量(ng)[24]。消化液中PFOA的总量即可利用的PFOA总量，等于消化液中PFOA的浓度乘以消化液总体积。样本中PFOA的总量等于样本中PFOA的蓄积量和样品质量的乘积。本研究设置了纯清水组作为空白对照，计算修正值。

1.4 仪器和试剂

LC-20A超高效液相色谱仪(Shimadzu，日本)；QTRAP 5500三重四极杆复合线性离子阱质谱仪(AB Sciex，美国)；N-EVAP 112氮吹仪(Organomation，美国)；冷冻离心机(3K15，德国Sigma)；57250-U固相萃取装置(Supelco，美国)。

PFOA标准品(Sigma，美国)，MPFOA(Wellington，加拿大)，甲醇、乙腈、超纯水(质谱级，Sigma，美国)，Oasis PRIME HLB固相萃取柱(6 mL,200 mg,Waters，美国)。

1.5 膳食调查

根据经济贝类主食区域消费主体特点，设计了膳食调查纸质调查问卷，于各采样点及周边区域随机分发。调查问卷的内容主要包括姓名、性别、年龄区间(20～30岁、31～40岁、41～50岁、51～60岁和61岁以上)、家庭用餐人数、每月食用贝类(菲律宾蛤仔、紫贻贝、扇贝、牡蛎和螠蛏)的频次(一个月1次、一个月2～3次、每周次数)和每次的购买量(kg)，饮食时是否伴有佐食和其他补充说明。

1.6 风险商

HR=(EDI×BA)/RfD

EDI=单位体重的居民每日贝类膳食量(kg·kg-1·d-1)×贝类中PFOA蓄积量(以干质量计)(μg·kg-1)

1.7 数据分析

数据分析软件采用GraphPad Prism 9、SPSS 22.0和Excel 2020。样品中PFOA含量以干质量计，含量低于检出限的或未检出的以0计入。

2 结果(Results)

2.1 胶州湾贝类中的PFOA蓄积量分析

不同取样点5种贝类的PFOA蓄积量如表1所示。调查显示，薛家岛、刘公岛等处的贝类产品中PFOA含量较低，而来源于新贵都、河西以及周家村等处的产品中PFOA含量稍高。对于不同品种的贝类来说，菲律宾蛤仔和扇贝中的PFOA蓄积量相对较高，明显高于其他品种。来源于不同采样点的菲律宾蛤仔中PFOA蓄积量范围为0.17～3.09 μg·kg-1，扇贝中PFOA蓄积量范围为0.23～3.36 μg·kg-1。

表1 不同取样点5种贝类的全氟辛酸(PFOA)蓄积量Table 1 Accumulation of perfluorooctanoic acid (PFOA) of 5 shellfish speices in different sample points (μg·kg-1)

2.2 不同贝类中的PFOA生物可给性

根据贝类样品中的PFOA蓄积量测定结果推算出2 g贝类样品中PFOA的含量。根据1.3.3中的方法，体外模拟胃消化过程，测定出样品中人体可利用的PFOA总量。进而计算得到PFOA的生物可给性(表2)。

如表2所示，不同贝类中的生物可给性从16.7%(蛤仔)到41.9%(螠蛏)，证明了随着贝类产品进入人体的PFOA不会经过胃消化过程全部进入消化液中而被人体吸收。与Li等[25]通过生物利用度提取模型(physiologically based extraction test,PBET)的方法测得的9.8%～99%结果一致。取以上贝类品种中的生物可给性均值即26.9%，进行健康风险评价。

表2 5种贝类胃消化过程中PFOA的生物可给性Table 2 Bioaccessibility of PFOA in 5 shellfish species by digestive process of stomach

2.3 膳食调查的结果

在针对胶州湾地区居民开展的贝类膳食调查中，共计100份有效数据被采集。

根据调查结果，胶州湾地区居民总体平均贻贝膳食量为0.05 kg·kg-1·d-1，牡蛎0.13 kg·kg-1·d-1，扇贝0.08 kg·kg-1·d-1，螠蛏kg·kg-1·d-1，菲律宾蛤仔0.14 kg·kg-1·d-1(表3)。受调查群体普遍对螠蛏的膳食量较小，在5种贝类中摄食比例仅占4%。对牡蛎和菲律宾蛤仔的膳食量较高，占30%及以上，其次为扇贝，膳食量占比为21%(图2)。另外，在本次受调查群体中，男性人员占51%，女性为49%。而结果显示，受调查群体的性别对于贝类品种的选择并无倾向性。然而，年龄对于品种的喜好性具有明显的差异：中青年人群(20～60岁)偏好贻贝，而老年人群(60岁以上)更偏好菲律宾蛤仔(图3)。

图2 胶州湾地区不同性别居民5种贝类的膳食比例Fig. 2 Dietary proportion of 5 shellfish species among residents of different genders in Jiaozhou Bay

图3 胶州湾地区不同年龄居民5种贝类膳食比例Fig. 3 Dietary proportion of 5 shellfish species among residents of different ages in Jiaozhou Bay

表3 胶州湾地区居民5种贝类每日平均膳食量Table 3 Daily average intake of 5 shellfish species in Jiaozhou Bay (kg·kg-1·d-1)

2.4 风险商值的计算

风险商值根据1.6中的公式进行计算，RfD选用小鼠中的数值，0.33 μg·kg-1·d-1[26]。青岛市居民平均体质量为60 kg左右。综上，经研究，胶州湾地区贝类中的PFOA风险商值较小，HR均<1，数量级在10-3～10-5之间(表4)。

表4 胶州湾地区5种贝类的PFOA风险商值(HR)Table 4 The harzard ratio (HR) of PFOA from 5 shellfish species in Jiaozhou Bay

3 讨论(Discussion)

胶州湾是典型的半封闭型海湾，其湾口有多条河流汇入，并直接进入黄海。因此，胶州湾也是各类陆源排放物的入海必经途径之一。2019年青岛市贝类产量达73.4 t，胶州湾是最大的主产区之一。然而，近年来，人类活动日益增加，部分河口污染严重，胶州湾海域养殖能力趋于下降。贝类的质量安全与品质亟待评价。鉴于此，基于前期的研究数据[26]，开展了典型经济贝类中的PFOA健康风险评价。

在本次研究中，沿胶州湾沿线，选择了6个不同区域的采样点，并确认采样点的样品均来自附近海域。样品采集范围覆盖面广，采集量大，保证了样品数据的准确性。本研究表明，菲律宾蛤仔和扇贝中的PFOA蓄积量相对较高，明显高于其他品种，这与崔文杰等[27]的研究结果相似。然而，多年来的研究表明，贻贝对于海洋中的污染物具有较突出的富集能力，已被多个国家用于海洋污染监测的指示品种。在本研究中，贻贝中的PFOA含量并没有特别突出。推测主要可能是贻贝对于PFOA并没有特异性的富集效应，同时对于此类物质具有相对突出的解毒能力[28-29]，由于本次采集样品均为市场购买，样品均经海水短暂净化，体内的PFOA具有一定的代谢及清除，因此导致贻贝体内的PFOA含量并未十分突出。此外，近年来的研究表明，无论在植物、哺乳动物或是在鱼类体内，均发现对PFOA的蓄积能力与生物体本身的蛋白质含量和游离脂肪酸含量有关。蛋白质含量低则意味着和PFOA结合的概率也降低，因此蓄积能力也下降。而游离的脂肪酸是通过竞争结合位点的方式影响外源物质和内源物质的结合，进而影响PFOA的蓄积。贝类中是否也存在如此机制，亦或是海水的污染是否对贝类的品质产生了一定程度的影响，降低了游离脂肪酸和蛋白质的含量，进而导致其污染物的蓄积能力下降，还有待于进一步的探究[30-31]。此外，由表1可知，同一种贝类不同农贸市场来源之间的PFOA累积量也有较大区别，这可能与不同水质和养殖环境有关，将进一步展开研究。在本次膳食调查中，发现消费者的性别对于饮食习惯没有明显的影响，而年龄的不同使得摄食喜好略有差别。然而，调查亦发现，胶州湾地区不同海域的居民饮食习惯本就有地域性差异。如红岛地区盛产优质牡蛎，本地区居民的牡蛎摄食量明显高于其他品种。另外，海产品尤其是贝类的摄食量或摄食频率具有季节性差异，贝类生长繁殖的旺季其市场销量明显上升。本次膳食调查开展时间为4—6月，为贝类销售的淡季转入旺季的时期，收集到的数据相对客观、准确。

基于上述结果，进一步计算了贝类中PFOA的生物可给性及风险商值。其中，选择可靠的RfD值至关重要。然而，众多的环境保护机构各自开展毒理学实验并进行建模，最终得出的RfD值差异很大。目前，US EPA的研究数据权威性较高，其针对PFOA的RfD为0.33 μg·kg-1·d-1，已被众多科研人员采用[32-34]。因此，本研究采用了该RfD值。然而，随着污染物的日益增多，健康风险评价的结果愈加需要准确、客观。因此，在今后的健康风险调查中，建议综合采用多家权威机构的多套毒理学数据，建立更加精确的数学模型，以优化RfD值的准确性。Pachkowski等[35]从免疫毒性这一角度出发，对PFOS的RfD进行推导。Chou和Lin[36]利用PBPK模型和贝叶斯曲线对PFOS的RfD进行了修正，修正值介于多家权威机构给出的建议值之间，该运算方式已用于其他全氟烷基类物质的RfD推导，PFOA的RfD推导亦可参考。根据US EPA提供的PFOA的RfD值，对本次调查样品进行了生物可给性的计算，发现其范围在16.7%～41.9%之间。风险商值均在10-3～10-5数量级之间，HR值远<1，与以往的研究结果类似[37]。可见胶州湾地区贝类中的PFOA健康风险较低，可以放心食用。

本文仅对贝类中蓄积量相对较高的PFOA进行了健康风险评价。海洋环境中存在着几十种全氟类化合物的污染。不同类型的全氟类化合物或与其他类型的污染物之间可能会加强或拮抗污染物的健康风险，这需要进一步开展联合风险评价研究。

面对全球趋于恶化的海洋生态环境以及POPs种类的日益增加，建议相关部门加强管理，开展近海海域环境及生物样品中全氟类污染物的定期监测，加快推进高效、灵敏的防控预警技术研发，加强不同类型污染物的联合风险评价研究。综上，本研究对建立全氟类化合物的健康风险评价模型，使得海洋环境中的全氟化合物污染可防可控，为海洋养殖业的健康绿色发展起到一定的积极作用。