淫羊藿苷改善重症急性胰腺炎模型大鼠肺损伤

谷文浩，郭飞霞，徐宇鹏，陆馨雨，胡青青

(1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310000； 2.温州市鹿城区人民医院 内科，浙江 温州 325000； 温州医科大学附属第一医院 3.转化医学实验室； 4.第一临床医学院； 5.儿科，浙江 温州 325000)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)最主要的致死机制是系统性炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS),其是导致包括肺损伤，成人呼吸窘迫综合征在内的多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的共同病理生理基础[1]。急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的发生率高居MODS所有累及脏器第一位，是SAP早期死亡的首要原因[2]。

中国中医药经过几千年的传承和发展，发现了大量药材含有抑制机体炎性反应的有效成分。国内外学者从淫羊藿(epimedium)中提取其主要药理成分-淫羊藿苷(icariin, ICA)，发现其能有效保护脑缺血/再灌注损伤,抑制脊髓损伤氧化应激和炎性反应[3-4]。但其对SAP所致SIRS和肺损伤的保护作用研究还属空白。本文旨在探讨淫羊藿苷(ICA)保护SAP大鼠肺损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级8周龄雄性SD大鼠18只，体质量210～220 g[由温州医科大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCXK(浙)2020-0001]。大鼠饲养在相对湿度为50%±1%、温度为(24±1)℃、每天黑暗及光照时间各12 h环境下。大鼠自由进食，自由饮水，2只1笼饲养。所有动物研究严格按照温州医科大学动物保健机构指南进行。

1.1.2 试剂及试剂盒：C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p-JNK、NF-κB、p-NF-κB抗体(Cell Signaling Technology公司)；IL-6、IL-1β和TNF-α抗体(Bioworld公司)；淫羊藿苷(ICA,北京源叶生物科技有限公司提取，纯度≥97%)；HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)；牛黄胆酸钠(Sigma-Aldrich公司)；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA测定试剂盒(上海联科生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(SAP组，将5%牛黄胆酸钠按0.1 mL/kg的剂量逆行泵入胆总管；牛黄胆酸钠可诱导胰腺内胰蛋白酶激活，致使胰腺充血坏死，其SAP病理改变更接近临床[5])和实验组(ICA组，于造模前2 h灌胃淫羊藿苷 80 mg/kg进行干预)。每组6只，24 h后观察各组大鼠状态，均无死亡。收集胰腺、肺脏组织以及下腔静脉血清用于后续检测。

1.2.2 HE染色检测肺脏和胰腺病理损伤程度:将胰腺组织和肺组织用4%多聚甲醛固定，乙醇浓度梯度脱水后石蜡包埋。蜡块用切片机制备5 μm厚度的组织切片，经脱蜡后按说明书操作进行HE染色，光镜下观察肺脏和胰腺病理损伤程度(采用改良Schmidt法[6]对胰腺损伤程度进行评分，采用Gustavo Matute-Bello法[7]对肺损伤程度进行评分)。

1.2.3 ELISA检测血清中淀粉酶活性、IL-6、IL-1β和TNF-α含量:按照操作说明书测定大鼠血清中淀粉酶活性、IL-6、IL-1β和TNF-α含量。

1.2.4 免疫组织化学染色检测IL-6、IL-1β和TNF-α表达量:肺组织切片脱蜡，用3% H2O237 ℃处理10 min后用5%山羊血清37 ℃封闭30 min。用稀释系数为1∶200的IL-6、IL-1β和TNF-α一抗4℃孵育过夜；洗涤后，用二抗对切片37 ℃孵育30 min；洗涤后，滴入DAB显色光镜下观察阳性区域并用Image J软件定量。

1.2.5 蛋白质印迹检测JNK/NF-κB信号通路蛋白表达：将肺组织匀浆于RIPA裂解液中并收集上清液。用BCA方法检测总蛋白浓度后，用SDS-PAGE分离等量蛋白质(30 μg)并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1 h,然后在4 ℃下与一抗p-JNK(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)以及NF-κB(1∶1 000)孵育过夜。所有的膜均用Tris-缓冲液清洗3次并与二抗在室温下孵育1 h。最后使用增强化学发光液将条带可视化并用Image J软件定量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 淫羊藿苷(ICA)显著减轻SAP大鼠胰腺和肺组织病理损伤

SAP组胰腺腺泡细胞间质水肿、出血和坏死并伴有大量炎性浸润；与SAP组相比，ICA组病理改变显著减轻(图1A)；胰腺病理评分明显降低(P<0.01)(图1B)。SAP组表现为肺泡间质厚度增加，肺泡塌陷，炎性细胞浸润；ICA组肺结构有明显改善(图1A)。与sham组相比，SAP组肺损伤评分明显上升(P<0.01)，而ICA组肺损伤评分明显低于SAP组(P<0.01)(图1C)。

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with SAP group (scale bar=200 μm)图1 淫羊藿苷显著减轻SAP模型大鼠胰腺和肺组织病理损伤Fig 1 Icariin significantly attenuated pathological injury of pancreas and lung tissue in SAP rat models

2.2 淫羊藿苷(ICA)减轻SAP大鼠血清淀粉酶活性和炎性因子含量

SAP组大鼠血清淀粉酶活性、IL-6、 IL-1β和TNF-α含量均显著高于sham组(P<0.01)；ICA组大鼠血清淀粉酶活性、IL-6、 IL-1β和TNF-α含量均显著低于SAP组(P<0.01)(表1)。

表1 淫羊藿苷减轻SAP模型大鼠血清淀粉酶活性和炎性因子含量Table 1 Icariin attenuated serum amylase activity and inflammatory factor contents in SAP rats

2.3 淫羊藿苷(ICA)减轻SAP大鼠肺组织中炎性因子含量

SAP组肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达量明显高于sham组(P<0.01)；ICA组肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达量均明显低于SAP组(P<0.01)(图2)。

IOD:integrated optical density; *P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with SAP group (scale bar=200 μm)图2 淫羊藿苷减轻SAP模型大鼠肺组织中炎性因子含量Fig 2 Icariin attenuated the contents of inflammatory factors in lung tissue of SAP rat

2.4 淫羊藿苷(ICA)显著降低SAP大鼠肺组织中磷酸化JNK和磷酸化NF-κB水平

SAP组肺组织中磷酸化JNK和磷酸化NF-κB水平较sham组明显升高(P<0.01)；ICA组磷酸化JNK和磷酸化NF-κB水平较SAP组明显降低(P<0.01)(图3)。

*P<0.01 compared with sham group； #P<0.01 compared with SAP group图3 淫羊藿苷显著降低SAP模型大鼠肺组织中磷酸化JNK和磷酸化NF-κB水平Fig 3 Icariin significantly decreased the levels of p-JNK and p-NF-κB in lung tissue of SAP rat

3 讨论

目前国内外所使用的针对负调控SIRS和保护SAP肺损伤的临床抗炎药物疗效均不显著。中国中医药中大量药材含有抑制机体炎性反应的有效成分,为探寻SAP治疗新方法提供了全新思路。

SAP发生时，胰腺消化自身组织释放大量蛋白水解酶和血管活性物质，首先激活机体单核巨噬细胞系统，释放大量TNF-α、IL-6等炎性细胞因子，进而使多形核粒细胞(polymorphonuclear granulocyte, PMN)活化。大量过度激活的PMN释放诸如氧自由基，脂质代谢产物等破坏性炎性介质，从而形成级联反应，进入恶性循环状态[8]。肺脏是SIRS过度激活的主要受累脏器，是高浓度细胞因子，活化的中性粒细胞攻击的主要靶器官。而肺内细胞对这些因子和细胞的反应也是导致肺损伤的关键因素[9]。SAP一旦发生相关肺损伤，如无有效干预手段或医疗干预不当，极易致死。

本研究证实淫羊藿苷对SAP模型大鼠SIRS具有明显的抑制作用,能降低其胰腺病理评分并显著减少胰腺淀粉酶释放。此外，本研究还发现淫羊藿苷抑制肺损伤病变过程中产生的IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子的表达，减轻SAP引发的肺损伤。这是淫羊藿苷通过负调控SIRS,减轻SAP肺损伤的表现。

JNK是丝裂原活化蛋白激酶的主要成员之一，它在细胞周期、增殖、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用[10-11]。JNK在真核细胞的胞质中广泛分布，一旦细胞受到细胞因子、应激、表皮生长因子等刺激因素损伤时，迅速发生磷酸化并转移入核，作用于下游的NF-κB等转录因子，从而在炎性应激反应中起到重要作用[12]。已有研究表明，在模型大鼠SAP早期，肺组织中JNK信号通路即被激活，从而上调NF-κB的磷酸化表达，而活化的NF-κB又可进一步上调肺组织中TNF-α、ICAM-1、IL-1β表达，二次加重肺组织炎性反应和损伤[13]。本研究发现SAP模型大鼠肺组织中磷酸化JNK和磷酸化NF-κB的表达水平显著上调，而淫羊藿苷能显著抑制JNK和NF-κB的磷酸化。

综上所述，SAP模型大鼠中应用淫羊藿苷干预，可能通过抑制JNK/NF-κB信号通路介导的全身急性炎性反应，有效减轻SAP模型大鼠胰腺损伤和肺损伤，为深入研究提供实验依据。