富马酸氯马斯汀减轻小鼠肠缺血/再灌注损伤

刘 洋，录亚鹏，郝 伟，钟海莲，刘婕婷，王迎斌

(兰州大学第二医院 麻醉科， 兰州大学 第二临床医学院，甘肃 兰州 730030)

肠缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤又称再灌注损伤是临床常见的病理生理过程。由此引起的临床疾病称为再灌注综合征。肠I/R诱发的局部和全身炎性反应可造成多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，病死率达30%～90%[1]。据报道，肠组织内NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体活化半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)并伴有大量促炎性因子释放诱发的促炎性程序性细胞死亡方式，在肠I/R的病理生理过程中起着关键作用[1]。抑制NLRP3炎性小体的激活可抑制I/R引起的肠道炎性反应，减轻肠损伤[2]。因此NLRP3炎性小体可能是肠I/R损伤的有效治疗靶点。

富马酸氯马斯汀(clemastine fumarate，CLE)，是组胺1受体(histamine 1 receptor，H1R)拮抗剂，主要参与机体变态反应。有报道CLE能抑制炎性反应，减轻器官缺血再灌注损伤[3-4]，但其对肠I/R损伤过程中的机制尚不清楚。本研究拟观察CLE是否影响小鼠肠I/R损伤及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

1.1.1 动物：SPF级Balb/c小鼠24只，体质量18～25 g，雄性(中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心)。

1.1.2 试剂：CLE(上海蓝木化工有限公司)；TNF-α、IL-18及IL-1β ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司)；NLRP3抗体(Abcam公司)；Caspase-1抗体和消皮素D(gasdermin D，GSDMD)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司)；蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物技术有限公司)；ECL发光液(Millipore公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物的分组及处理：小鼠随机分为假手术组(sham组)、I/R组和CLE组，每组8只。CLE组术前1 h腹腔注射CLE 5 mg/kg。建立肠系膜上动脉分支夹闭模型(缺血40 min，再灌注2 h)[5]。Sham组小鼠行相同手术但不做夹闭处理。异氟醚麻醉，眼眶静脉采血。过量麻醉致死收集盲肠上5 cm 缺血/再灌注肠组织。

1.2.2 肠组织病理检测：小肠组织石蜡包埋切片，HE染色。光镜下观察肠黏膜病理变化。采用Chiu’s评分：正常为0分；绒毛顶端上皮下间隙增宽为1分；绒毛顶端上皮下间隙进一步扩大，绒毛尖端上皮抬高与固有膜剥离为2分；绒毛上皮成块脱落为3分；上皮完全脱落，仅有固有膜为4分；固有膜层崩裂，出现出血与溃疡为5分。

1.2.3 ELISA检测血清炎性因子：眼眶静脉取静脉血样800～1 000 μL，室温静置1h，离心，分离血清。按ELISA试剂盒说明检测和计算血清TNF-α、IL-1β及IL-18水平。

1.2.4 Western blot检测NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白表达：按照常规方法检测并分析肠组织NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白的表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肠黏膜病理改变

Sham组肠黏膜完整，绒毛直立排列整齐；I/R组绒毛顶部结构大片缺失，绒毛失去基本结构，大量炎性细胞浸润，红细胞淤积；CLE组绒毛结构基本存在，但绒毛出现倒伏，Gruenhagen’s间隙扩大，小部分绒毛顶端有缺失，伴较多炎性细胞浸润。与sham组相比，I/R组和CLE组Chiu’s评分明显升高(P<0.05)；与I/R组相比，CLE组Chiu’s评分显著降低(P<0.05)(表1，图1)。

表1 各组小鼠肠黏膜病理Chiu’s评分结果

图1 各组小鼠肠组织HE染色Fig 1 Intestinal tissues of mice in various groups by HE (×40，×100)

2.2 血清TNF-α、IL-1β及IL-18含量

与sham组相比，I/R组及CLE组血清TNF-α、IL-18及IL-1β明显升高 (P<0.05)； 与I/R组相比，CLE组血清TNF-α、IL-18及IL-1β显著降低(P<0.05)(表2)。

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-18含量

2.3 肠组织NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白表达水平

与sham组相比，I/R组缺血再灌注肠组织NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白表达量明显上升(P<0.05)； 与I/R组比较， CLE组缺血再灌注肠组织NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白表达量显著降低(P<0.05)(图2)。

A.expression of NLRP3, caspase-1 and GSDMD proteins by Western blot; B.bar graph of NLRP3, caspase-1 and GSDMD proteins expression;*P<0.05 compared with sham group； #P<0.05 compared with I/R group

3 讨论

H1R在小肠黏膜中广泛分布，其激活可加速氧自由基的生成，诱导中性粒细胞聚集，介导炎性反应加重肠组织损伤[6]。H1R拮抗剂可以抑制肥大细胞(mast cell，MC)脱颗粒作用，减少组胺和促炎性细胞因子的释放[3]。大鼠肠I/R模型中抑制MC脱颗粒，可抑制肠道炎性反应，减轻肠组织损伤[7]。本实验观察到，CLE降低肠黏膜损伤Chiu’s评分，提示CLE可减轻I/R肠黏膜损伤。

激活的NLRP3炎性小体通过活化caspase-1切割GSDMD，致GSDMD的N端结构域在质膜中形成孔洞，释放细胞内大量IL-1β和IL-18，进而引发细胞死亡裂解， 发生爆发性的炎性反应[8]。NLRP3炎性小体在肠早期再灌注2～4 h发生渐进激活，相关的Chiu’s评分和炎性细胞因子也随之明显上升[1]。本实验观察到CLE降低了肠组织NLRP3、caspase-1及GSDMD细胞焦亡相关蛋白的表达，并下调血清TNF-α、 IL-1β及IL-18炎性细胞因子的含量，提示CLE可能通过抑制I/R肠组织NLRP3炎性小体的激活, 从而减轻肠道炎性反应。

病原相关分子模式(pathogen-associated mole-cular patterns，PAMPs)可活化NF-κB通路，上调NLRP3和IL-1β表达；多种PAMPs和损伤相关分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)则促进NLRP3炎性小体的组装与激活。本研究观察到CLE减少I/R肠组织NLRP3炎性小体的表达。据报道，CLE可抑制器官I/R中Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)的表达[3,9]。TLR4可通过MyD88激活NF-κB依赖性和非依赖性途径, 导致NLRP3表达增加[10]。抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，有效减轻肠I/R损伤[11]。肠I/R还可诱导大量MC活化并造成TLR4、NF-κB和TNF-α的过表达[12]，MC脱颗粒促进剂compound40/80可促进NLRP3炎性小体的表达，而给予MC膜稳定剂则出现相反的结果[7]。因此推测CLE抑制了NLRP3炎性小体的激活可能与抑制TLR4的表达和/或抑制MC脱颗粒相关。

综上所述，第二代H1R拮抗剂CLE，减轻肠I/R损伤，其机制可能通过抑制肠组织NLRP3炎性小体激活。进一步探讨CLE调控NLRP3炎性小体的机制可为肠I/R的防治提供新的实验基础。