Circ_0032821参与索拉非尼抑制乳腺癌细胞系T47D增殖、迁移和侵袭

张晓雷，刘 静，李朝萍

(黄河三门峡医院 1.乳腺外科； 2.健康体检科, 河南 三门峡 472000； 3.郑州大学附属洛阳中心医院 肿瘤中心, 河南 洛阳 471000)

索拉菲尼(sorafenib)是一种广谱口服多激酶小分子抑制剂，已被美国食品和药物管理局批准用于治疗晚期肾细胞癌、转移性肝癌[1]。研究显示，在乳腺癌异种移植瘤和转移模型中，索拉菲尼可抑制血管生成、转移，提高环磷酰胺的抗肿瘤活性[2]。然而，索拉非尼在乳腺癌中的抗癌作用和分子机制并未阐明。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类在组织和细胞中广泛存在的非编码RNA，通过与微小RNA(microRNA，miRNA)结合间接调节靶mRNA表达参与多种细胞过程。目前已证实，circRNA表达改变与乳腺癌进展的多个过程相关[3-4]。研究报道circ_0032821在胃癌中表达上调，可能是胃癌淋巴结转移和预后不良的生物标志物。敲除circ_0032821可导致细胞增殖、上皮间质转化和迁移受到抑制[5]。然而，circ_0032821在乳腺癌中的表达和功能尚不清楚。因此，本研究拟通过分析索拉菲尼对乳腺癌细胞系T47D增殖、迁移和侵袭以及circ_0032821表达的影响，旨在揭示索拉菲尼在乳腺癌中抗癌作用和潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞：人乳腺癌细胞系T47D(中国科学院上海细胞库)。

1.1.2 试剂和试剂盒：索拉非尼(纯度≥98.5%，先用二甲基亚砜配置成母液，后用细胞培养液液稀释至实验浓度；海南满方园医药公司)；Circ_0032821小干扰RNA(circ_0032821 small interfering RNA，si-circ_0032821)及其阴性对照(small interfering RNA negative control，si-NC)、circ_0032821过表达质粒(circ_0032821 over-expressed plasmid，pcDNA-circ_0032821)(上海生工生物公司)；SYBR Green Master Mix试剂盒和细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit，CCK-8，南京诺唯赞生物公司)；TRIzol提取(上海碧云天生物公司)；Lipofectamine 2000和M-MLV反转录酶(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养和分组：将T47D细胞用含10%胎牛血清的杜尔伯格伊戈尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)，于含5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养。胰蛋白酶消化已达80%汇合的细胞为单个细胞；按照1∶3比传代培养。在6孔板中接种2×105个对数期T47D细胞。按照Lipofectamine 2000使用说明将si-NC、si-circ_0032821或pcDNA-circ_0032821分别转染50%汇合的T47D细胞。在转染48 h时，用RT-qPCR检测T47D细胞中circ_0032821相对水平以验证转染效果。实验分组：用分别含2.5、5或10 μmol/L索拉非尼[6]的培养液孵育T47D细胞；转染si-NC和si-circ_0032821的T47D细胞分别记为si-NC组和si-circ_0032821组；用含10 μmol/L索拉非尼的培养液孵育转染pcDNA-circ_0032821的T47D细胞，记为索拉非尼+pcDNA-circ_0032821组。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖：在96孔板中接种4×103个未转染或转染后T47D细胞。给予含对应索拉非尼浓度的培养液孵育48 h，更换为含10% CCK-8的培养液，再孵育2 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)。增殖抑制率(%)=(1-实验孔A/对照孔A)×100%

1.2.3 平板集落实验检测细胞增殖能力：在6孔板中接种200个各组T47D细胞，轻轻晃动平板使细胞均匀分散，放入培养箱孵育12～15 d，当细胞成为集落时终止培养。弃去细胞悬液，分别用4%多聚甲醛固定、0.1%结晶紫染色。在显微镜下计数各组T47D细胞(大于50个细胞)集落数。

1.2.4 划痕愈合率实验检测细胞迁移：将各组T47D细胞接种于6孔板，每孔1×104个细胞，用1 mL枪头垂直于6孔板底部划伤单层细胞。替换为无血清培养基，将6孔板放入培养箱培养。在培养0和24 h时拍照，ImagJ软件测量划痕宽度。划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%

1.2.5 Transwell小室法检测细胞侵袭：每组取3×103个T47D细胞重新悬浮于200 μL无血清培养基中并接种Transwell上室(包被基质胶涂层)，将600 μL补充20%胎牛血清的DMEM培养基加入下室。孵育24 h，灭菌棉签除去Transwell室膜上表面附着细胞和基质胶，4%多聚甲醛固定Transwell室膜下表面细胞，0.1%结晶紫染色。在倒置显微镜下计数5个随机视野细胞总数，取均值表示T47D细胞侵袭数量。

1.2.6 RT-qPCR检测circ_0032821表达：用TRIzol提取各组T47D细胞总RNA。其纯度和浓度采用分光光度法计算。为检测circ_0032821表达，用M-MLV酶进行反转录，用SYBR Green Master Mix试剂盒进行RT-qPCR。采用2-ΔΔCt法分析circ_0032821相对表达量。Circ_0032821上游引物：5′-AGGAATCT GAGTTGCAGTGTCTC-3′，下游引物：5′-TGATCCTT GAGCTGCAATCTGG-3′。内参磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 索拉非尼对T47D细胞恶性行为的影响

与对照组比较，索拉非尼(2.5、5和10 μmol/L)组T47D细胞增殖抑制率显著升高，集落形成数、划痕愈合率及侵袭数量均显著降低(P<0.05)，且索拉非尼对T47D细胞生物行为的抑制作用呈浓度依赖性(表1,图1)。

表1 索拉非尼抑制T47D细胞增殖、迁移和侵袭Table 1 Sorafenib inhibited the proliferation, migration and invasion of T47D

A.effect of sorafenib on T47D colony formation; B.effect of Sorafenib on T47D scratch healing(×40); C.effect of sorafenib on the number of T47D invasion cells(scale bar=200 μm)

2.2 索拉非尼对T47D细胞中circ_0032821表达的影响

与对照组比较，索拉非尼(2.5、5、10 μmol/L)组T47D细胞circ_0032821相对水平显著降低(P<0.05)。且索拉非尼对circ_0032821表达的抑制作用呈浓度依赖性(表2)。

表2 索拉非尼对T47D细胞中circ_0032821表达的影响

2.3 沉默circ_0032821对T47D细胞增殖、迁移和侵袭的影响

Si-circ_0032821组T47D细胞中circ_0032821相对水平显著低于si-NC组，表明转染si-circ_0032821后circ_0032821的表达受到抑制。与si-NC组比较，si-circ_0032821组T47D细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)，集落形成数、划痕愈合率、侵袭数量显著降低(P<0.05)(图2，表3)。

A.effect of silence circ_0032821 on T47D colony formation; B.effect of silence circ_0032821 on the number of T47D invasion cells(scale bar=200 μm); C.effect of silence circ_0032821 on T47D scratch healing(×40)

表3 沉默circ_0032821抑制T47D细胞增殖、迁移和侵袭Table 3 Silencing circ_0032821 inhibited the proliferation, migration and invasion of T47D

2.5 过表达circ_0032821对索拉非尼处理的T47D细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与对照组比较，索拉非尼组T47D细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)；集落形成数、划痕愈合率、侵袭数量以及circ_0032821相对水平显著降低(P<0.05)；与索拉非尼组比较，索拉非尼+pcDNA-circ_0032821组T47D细胞增殖抑制率显著降低(P<0.05)，集落形成数、划痕愈合率、侵袭数量以及circ_0032821相对水平显著升高(P<0.05)(图3，表4)。

A.over-expression of circ_0032821 can reverse the effect of sorafenib on T47D colony formation; B.over-expression of circ_0032821 could reverse the effect of sorafenib on T47D scratch healing(×40); C.over-expression of circ_0032821 could reverse the effect of sorafenib on T47D invasion(scale bar=200 μm)

表4 过表达circ_0032821可逆转索拉非尼对T47D细胞恶性行为的抑制作用

3 讨论

索拉菲尼通过抑制肿瘤生长、转移和血管生成，诱导细胞凋亡，在多种人类癌中表现出抗癌潜力。索拉菲尼可抑制细胞内酪氨酸激酶(Janus Kinase，JAK)/信号传导及转录活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)信号通路，进而诱导肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖[7]。业已发现[8-9]，索拉菲尼在肝癌中的促凋亡、抗血管生成作用与抑制促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MEK)/胞外信号调节激酶(extracel-lular regulated kinase，ERK)通路活化有关。也有研究证实[10]，索拉菲尼以剂量依赖方式诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。此外，有报道[11]，索拉非尼和多柔比星联用对肺癌细胞、乳腺癌细胞具有促凋亡作用。本研究探讨索拉菲尼对乳腺癌细胞生物行为的影响，结果表明，索拉菲尼处理显著抑制乳腺癌细胞T47D活力，降低其集落形成、迁移和侵袭能力，这与已有报道[12]结论吻合。转移是乳腺癌治疗失败的重要原因，因此索拉非尼通过抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移具有提高乳腺癌患者生存率潜力。

Circ_0032821表达异常已被证实与胃癌进展相关。胃癌组织和细胞系中circ_0032821表达上调。沉默circ_0032821则可抑制胃癌细胞的体外增殖、转移能力，抑制糖酵解代谢，抑制胃癌发生[13]。此外，circ_0032821通过靶向下调miR-515-5p促进胃癌细胞奥沙利铂耐药[14]。本研究发现，索拉菲尼处理后T47D细胞中circ_0032821表达水平显著下调。但circ_0032821低表达是否介导索拉菲尼的抗肿瘤作用并不清楚。本研究结果显示，干扰circ_0032821表达明显抑制T47D细胞活力，降低其集落形成、迁移和侵袭能力，这与索拉菲尼的抗肿瘤效果类似。进一步的逆转实验表明，过表达circ_0032821可减弱索拉菲尼对T47D细胞生物行为的抑制作用，提示下调circ_0032821可能是索拉菲尼在乳腺癌中发挥抗肿瘤作用的重要途径。

总之，索拉菲尼可有效抑制乳腺癌T47D细胞增殖、迁移和侵袭，其抗肿瘤机制可能是通过下调circ_0032821实现的，提示索拉菲尼是对抗乳腺癌转移的重要药物，并为乳腺癌治疗提供潜在有效靶点。